超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查克氏螯蝦中39種獸藥殘留

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查克氏螯蝦中39種獸藥殘留

元寶蝦，又稱紅螺旋蝦和小龍蝦，是市場上非常受歡迎的水產(chǎn)食品，也是中國的重要出口。殘留是影響現(xiàn)有g(shù)u蝦育種質(zhì)量安全的重要因素。樣品前處理技術(shù)是獸藥殘留分析的關(guān)鍵步驟,直接影響檢測結(jié)果。QuEChERS作為一種簡單、快速、高效的藥物多殘留的前處理方法,近些年已被引入獸藥殘留分析本文采用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化劑(EMR-Lipid,簡稱EMR)結(jié)合石墨化多壁碳納米管作為QuEChERS法吸附劑對克氏螯蝦樣品進(jìn)行前處理,同時采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)建立喹諾酮類、磺胺類、三苯甲烷類39種藥物殘留一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫及二級碎片譜圖庫。通過比對準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、保留時間等信息對目標(biāo)物進(jìn)行初篩,之后通過二級譜圖譜庫檢索比對進(jìn)行確證,最終以一級提取離子色譜圖峰面積進(jìn)行定量,建立適合于克氏螯蝦中39種獸藥殘留檢測的快速篩查方法。1實驗部分1.1化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)Agilent1290-6540超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(Agilent,美國);AvantiJ-E高速冷凍離心機(jī)(BeckmanCoulter,美國);N-EVAP112氮吹濃縮儀(OA-SYS,美國);PL602-L電子天平(Mettler,德國);T25均質(zhì)器(IKA,德國);VortexGenie2渦旋混勻器(ScientificIndustries,美國);Milli-Q超純水機(jī)(MerckMillipore,美國)。標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺醋酰(sulphacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)、磺胺吡啶(sulfapyridine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、三甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺對甲氧嘧啶(sulfameter)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺氯噠嗪(sulfachloropyridazine)、磺胺甲基異惡唑(sulfamethoxazole)、磺胺二甲異惡唑(sulfisoxazole)、磺胺苯酰(sulfabenzide)、磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)、磺胺喹惡啉(sulfachinoxalin)、磺胺苯吡唑(sulfaphenazole)、磺胺硝苯(sulfanitran)、麻保沙星(marbofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、丹諾沙星(danofloxacin)、恩諾沙星(enrofloxacin)、奧比沙星(orbifloxacin)、沙拉沙星(sarafloxacin)、雙氟沙星(difloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟甲喹(flumequine)、惡喹酸(oxolinicacid)、萘啶酸(nalidixicacid)、孔雀石綠(malachitegreen)、隱色孔雀石綠(leucomalachitegreen)、結(jié)晶紫(crystalviolet)、隱色結(jié)晶紫(leucocrystalviolet)(純度≥99%,德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲酸、乙酸、乙腈(色譜純,美國Tedia公司);氯化鈉、無水硫酸鎂、乙酸銨(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);PSA、C獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取上述39種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品各10mg(精確至0.1mg),分別置于10mL棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容,標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度均為1mg/mL,于-18℃避光保存。實驗中根據(jù)每種目標(biāo)化合物的定量限,用空白樣品提取液逐級稀釋配制成不同濃度的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。1.2全干預(yù)條件下的穩(wěn)定性將克氏螯蝦樣品去頭、去殼,取可食部分用勻漿機(jī)制樣,于-18℃冷凍貯存?zhèn)溆?。稱取4g(精確至0.01g)樣品于50mL離心管中,加入10mL1%(v/v)甲酸乙腈溶液,13500r/min均質(zhì)提取1min,于-4℃、10000r/min冷凍離心20min。取5mL上清液至預(yù)先用5mL水浸潤活化過的EMR-Lipid管中,渦旋振蕩2min,之后于4℃條件下10000r/min離心5min。取上清液5mL移入加有0.5g氯化鈉、2.0g無水硫酸鎂的反萃管中,渦旋振蕩1min后,于4℃條件下10000r/min離心5min,再將上層乙腈層轉(zhuǎn)移至加有30mg石墨化多壁碳納米管的凈化管中,渦旋振蕩2min,于4℃條件下10000r/min離心5min。最后取上層清液至10mL玻璃管中,在45℃用氮氣濃縮儀吹干,準(zhǔn)確加入500μL初始流動相溶解殘渣,過0.2μm濾膜,待上機(jī)檢測。1.3uhplc-q-tof模式1.3.1條件1色譜柱:安捷倫ZORBAXEclipsePlusC1.3.2uhplc-q-tof-ms電—質(zhì)譜條件離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;干燥氣溫度:325℃;干燥氣流速:10L/min;霧化器壓力:276kPa;鞘流氣溫度:300℃;鞘流氣流速:11L/min;毛細(xì)管電壓(capillaryvoltage):4000V;掃描方式:正離子掃描,targetMS/MS模式;TOF一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍(m/z):50~1000;碎裂電壓(FP):100V。UHPLC-Q-TOF/MS配置了雙噴霧器電噴霧源,可以連續(xù)導(dǎo)入?yún)⒈热芤簩x器質(zhì)量軸進(jìn)行實時校正。選取m/z121.0508和m/z922.0097作為參比離子,對測定的目標(biāo)物實時進(jìn)行質(zhì)量數(shù)校正,確保質(zhì)量數(shù)誤差小于5×102結(jié)果與討論2.1質(zhì)譜掃描及編輯質(zhì)譜條件中的碎裂電壓和碰撞能量是影響離子豐度的重要條件,與方法的靈敏度密切相關(guān)。首先通過化合物結(jié)構(gòu)式建立39種獸藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫,之后在ESI以不同藥物一級質(zhì)譜獲得精確質(zhì)量數(shù)的分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,得到不同碰撞能量下各化合物的二級質(zhì)譜圖,然后通過儀器自帶譜庫編輯軟件,建立39種獸藥信息及二級譜圖庫。根據(jù)各化合物不同碰撞能下的二級譜圖對比,選出合適的碰撞能量作為該藥物篩查方法的二級碰撞能(見表1)。2.2色譜條件優(yōu)化流動相是影響化合物離子化的重要條件,影響色譜峰形和分離效果。實驗比較了乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水、乙腈-5mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸水溶液3種流動相條件下色譜峰的分離及響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)在ESI2.3確定指標(biāo)檢索標(biāo)準(zhǔn)為保證篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性,實驗基于化合物的保留時間、一級母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比及二級質(zhì)譜特征碎片譜圖作為指標(biāo)建立檢索標(biāo)準(zhǔn)。采用targetMS/MS掃描模式,一針進(jìn)樣同時獲取一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)優(yōu)化,當(dāng)一級篩查以±20×102.4提取溶劑的選擇實驗比較了乙腈、1%(v/v)甲酸乙腈、乙酸乙酯、甲醇作為提取溶劑時的提取效果。其中以乙酸乙酯、甲醇提取時,提取液渾濁,提取效率低;以乙腈作為提取試劑時,雖能夠更有效地沉淀蛋白質(zhì),減少雜質(zhì)干擾,但部分化合物提取回收率較低;而采用1%(v/v)甲酸乙腈提取時,39種獸藥均取得了較好的提取效果,回收率均高于60%。因此實驗最終采用1%(v/v)甲酸乙腈作為提取溶劑。為減少樣品中脂類物質(zhì)的干擾,實驗在樣品提取后采用冷凍離心法,將乙腈提取液于-4℃10000r/min冷凍離心20min,吸取5mL上清液進(jìn)行下一步實驗。2.5優(yōu)化凈化條件本文分別考察了CNaCl可使樣品中的水分充分析出,從而有利于吸水劑的吸附。無水MgSO2.6方法的線性關(guān)系、加標(biāo)回收率和精密度根據(jù)目標(biāo)化合物在質(zhì)譜中的響應(yīng),以空白樣品提取液配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列,在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以相應(yīng)組分的響應(yīng)值為縱坐標(biāo),結(jié)果顯示39種獸藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r為了評估方法的準(zhǔn)確性,在LOQ、2LOQ及4LOQ3個添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗,每個水平做6個平行樣品,39種獸藥的回收率及RSD見表3,結(jié)果表明方法能夠滿足實際檢測的要求。2.7克氏螯蝦基因型篩查在最佳實驗條件下對20個克氏螯蝦樣品中的獸藥殘留進(jìn)行篩查,其中1份克氏螯蝦樣品檢出禁用藥物孔雀石綠,一級篩查得分90.3,二級確證得分75.4,含量為4.63μg/kg;1份克氏螯蝦檢出恩諾沙星,一級篩查得分96.5,二級確證得分92.1,含量為15.82μg/kg,未超出我國限量標(biāo)準(zhǔn)(見圖6);剩余樣品均未檢出這39種獸藥殘留。為了驗證檢測結(jié)果,實驗室參照國家標(biāo)準(zhǔn)