生物技術(shù)概論-基因工程

生

物

技

術(shù)

概

論基

因

工

程南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院

馬驪二〇〇六年五月十一日第一頁，共一百三十八頁。重組DNA技術(shù)的定義種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的

穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子

克隆技術(shù)。供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。第二頁，共一百三十八頁?；蚬こ痰亩x上游技術(shù)

下游技術(shù)上游技術(shù)下游技術(shù)基因工程的理論基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；基因是可切割的；基因是可以轉(zhuǎn)移的；多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系；遺傳密碼是通用的；基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳給下一代?；蚬こ痰幕驹硖岣咄庠椿虻膭┝俊肿舆z傳學(xué)原理篩選、修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如啟動子、增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列——分子生物學(xué)原理篩選、修飾蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件如SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子——分子生物學(xué)原理基因工程菌的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)——生化工程學(xué)原理第五頁，共一百三十八頁。基因工程的支撐技術(shù)基因工程的基本條件A

用于核酸操作的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶

DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶限制性內(nèi)切核酸酶A中特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)定位點(diǎn)上的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’-OHNA片段的內(nèi)切脫氧核苷酸酶?；蚬こ讨兴玫氖荌I型酶。屬名

種名

株名Haemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株Hind

III同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶第九頁，共一百三十八頁。1、限制性內(nèi)切酶的識別順序識別序列2、限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)酶的作用下，DNA雙鏈上磷酸二酯鍵斷開酶切位點(diǎn)，用

表示。酶切位點(diǎn)位于識別序列的側(cè)。如：G

AATTC、

GATC。不同的酶切割DNA分子后產(chǎn)生的末端不同：5’粘性末端、3’粘性末端、平末端。第十一頁，共一百三十八頁。-

-

-G-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-G-

-

--

-

-G-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-G-

-

--

-

-C-T-G-C-A-G-

-

--

-

-G-A-C-G-T-C-

-

--

-

-C-T-G-C-A-OHP-G-

-

--

-

-G-POH-A-C-G-T-C-

-

--

-

-C-A-G-C-T-G-

-

--

-

-G-T-C-G-A-C-

-

--

-

-C-A-G-OHP-C-T-G-

-

--

-

-G-T-C-POH-G-A-C-

-

-同裂酶來源不同，但具有相

的識同。I和Bst

I：識別GGATCC。同尾酶：有些限制性內(nèi)切酶雖識別序列不同，但酶切產(chǎn)生的DNA片段具有相同的末端。如：Taq

I、Cla

I和Acc

I，酶切均產(chǎn)生5’-CG末端。第十五頁，共一百三十八頁。限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的操作0-50

mM

低鹽酶100

mM

中鹽酶150

mM

高鹽酶Volume20

-

100

ulT

T37

℃

1

-

1.5

hr限制性內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶切原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：BamH

I

Sma

I5’

…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’

…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’

…

GCTACATG3’

…

CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ggcccAagcgta…5’5’

…GCTACATGGATCCC3’

…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’CCCaagcgta…5’第十七頁，共一百三十八頁。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度DNA樣品的甲基化程度酶的緩沖液性質(zhì)第十九頁，共一百三十八頁。DNA樣品的純度：加大酶的用量，1mg

DNA

用10U

酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時(shí)間DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中dam甲基化酶在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的有Bcl

I

Mbo

I等。大腸桿菌中dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的有EcoR

II等哺乳動物中甲基化酶在5’CG3’序列中C5位上引入甲基。酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度酶高濃度甘油低離子強(qiáng)度極端pH值等5’GAATTC3’5’AATT3’。DNA連接酶DNA連接酶T4

DNA連接酶用途：提高平端連接效率的方法加大連接酶用量（10倍于粘端的連接）；加大平末端DNA片段的濃度；加入10%PEG

8000；加入單價(jià)陽離子（NaCl），終濃度150-200

mM。DNA聚合酶用途：記的DNA探針5’

dNTP5’

ppp

dA（-32P-dATP）5’

…

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’3’

…

C-G-A-G-

-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’DNA

pol

I

Mg2+DNA

pol

I特性：具有5’→3’DNA聚合酶活性、5’→3’和3’→5’外切核酸酶活性。-

-

-

-A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’nickDNase

I5’

…

G-C-T-C

A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’3’

…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’第二十六頁，共一百三十八頁。Klenow酶Klenow酶特性：用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端；DNA片段的同位素末端標(biāo)記；cDNA第二鏈的合成；雙脫氧末端終止法測定DNA序列。補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端：-

-

-G-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-G-

-

--

-

-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-

-

-DNA片段的同位素末端標(biāo)記：…

G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C

…

5’Klenow5’

ppp

dA（

-32P-dATP）5’

…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…

5’第二十九頁，共一百三十八頁。T4

DNA聚合酶特性：在無dNTP時(shí)，從3’-OH端外切；在只有1種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止；在4種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端；DNA片段的同位素末端標(biāo)記。切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端：-

-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G

…

3’’

…

C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5T4

DNA

pol5’

…

G-C-T-C-

OH

P-G-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-G-P

HO

-C-C-T-C

…

5’第三十一頁，共一百三十八頁。反轉(zhuǎn)錄酶特性：用途：核酸酶單鏈核酸外切酶：切酶VII（ExoVII），不需Mg2+；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII），特異性從3’端核酸外切酶（Exo），特異性從5’端外切；單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶，內(nèi)切單鏈DNA或RNA、帶缺口或缺刻的雙鏈DNA；單鏈內(nèi)切雙鏈外切核酸酶：Bal31核酸酶，用于誘發(fā)DNA突變。第三十三頁，共一百三十八頁。Bal

31核酸酶EcoRIABCEcoRIB

CABCAAC核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）：堿性磷酸單酯酶（CIP、BAP

）

：T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）用于探針的末端同位素標(biāo)記。B

用于基因克隆的載體載體的功能及特征質(zhì)粒噬菌體或病毒DNACos質(zhì)粒人工染色體載體載體的功能及特征載體的功能：載體應(yīng)具備的條件：特征:1、質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒的構(gòu)建pSC101ColE18.8

kb

拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因Tcr6.5

kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124

ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr人工構(gòu)建的質(zhì)粒分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒低拷貝質(zhì)粒溫敏質(zhì)粒

測序質(zhì)粒

整合質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒探針質(zhì)粒pUC18

/

19：拷貝數(shù)2000-3000/cell裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）顏色選擇標(biāo)記lacZ’用于基因克隆和測序GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19顏色選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理:pUC18/19PlaclacZ’MCS-半乳糖苷酶的-亞基底物：5-溴-4-氯-3-吲哚X-gal）質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染沸水浴法質(zhì)粒DNA純度低、快速、操作簡便堿裂解法質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間2、噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率地感染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，在一定條件下這兩種狀態(tài)會相互轉(zhuǎn)化。3’3’CCCGCCGCTGGA

5’COS5’

TCCAGCGGCGGGGCOScosE.coli的噬菌體DNA:75-105%36

-

51

kb噬菌體的感染周期：E.coli吸附注入復(fù)制包裝裂解噬菌體的溶原狀態(tài)：（溶菌狀態(tài)）溶原狀態(tài)-DNA載體的構(gòu)建縮短野生型-DNA長度，可提高裝載量。野生型

-DNA中間40-50％的片段為生長非必需，根據(jù)切除多少，將

-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體1、縮短長度：野生型

-DNA包裝上限51kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段≤2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。插入型載體：如

gt系列。體外包裝插入位點(diǎn)載體長度：36

kb體外包裝插入片段0-15

kb載體長度：26

kb體外包裝插入片段插入片段大?。?0-25

kb取代型載體：2、刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)方法：3、加裝選擇標(biāo)記免疫功能類標(biāo)記：如imm434-噬菌體進(jìn)入溶菌imm434基因編碼一種阻止循環(huán)的阻遏物?？蛰d體進(jìn)入E.coli后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入imm434基因時(shí)，基因滅活，進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。顏色反應(yīng)類標(biāo)記：如lacZ-DNA重組分子的體外包裝：-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：25

kb動植物病毒克隆載體常用的動物病毒載體：用于構(gòu)建克隆載體的植物病毒：3、cos質(zhì)粒（cosmid）25kbcos質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：45

kb4、人工染色體載體將細(xì)菌接合因子或酵母染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即構(gòu)成人工染色體載體。50-300

kb350-400

kb。C

目的基因的獲得直接從染色體DNA中分離化學(xué)合成法從mRNA合成cDNAPCR法通過構(gòu)建基因文庫分離目的基因用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，得到很多與基因大小相當(dāng)?shù)腄NA片斷，把這些片段混合物隨機(jī)插入載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，做成基因組文庫，再通過核酸分子雜交，選擇出含目的基因的DNA片斷。僅適用于原核基因的分離。1、直接從染色體DNA中分離2、化學(xué)合成法小片段粘接法：12-15

bp補(bǔ)釘延長法：12-15

bp20-30

bp大片段酶促法：40-50

bp采用一定方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶I（或Klenow）合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法可得到可表達(dá)的完整基因。3、從mRNA合成cDNA雙鏈平頭cDNA使用下列方法克隆入載體：直接與載體連接；加人工接頭引入酶切位點(diǎn)；注意：加接頭前，先將DNA甲基化平頭兩端分別加同聚物尾。使用PCR法擴(kuò)增目的基因的前提：已知目的基因全序列或兩側(cè)序列，通過合成與模板互補(bǔ)的上下游引物，擴(kuò)增目的基因。由Taq

DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，3’端總是帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基--A，可用T載體克隆。4、PCR法擴(kuò)增目的基因基因文庫（gene

library

or

gene

bank）：從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆形式存在。5、通過構(gòu)建基因文庫分離目的基因根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含全部基因）cDNA文庫（含全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）基因組文庫基因組文庫：cDNA文庫cDNA文庫：幾種載體的最大裝載量比較：基因組文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題：基因組DNA的制備：為最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，基因組DNA在分離純化操作中應(yīng)避免過度斷裂。常規(guī)方法制備的染色體DNA長度100kb左右，如先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000

kb的DNA片段?；蚪MDNA的切割：超聲波處理：DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭；部分酶切法：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！從基因文庫中篩選目的基因：根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進(jìn)行篩選根據(jù)目的基因特異性表達(dá)進(jìn)行篩選根據(jù)目的基因已知核苷酸序列制備探針，對基因文庫一系列克隆子的DNA分子進(jìn)行雜交，能雜交的克隆就含有目的基因，進(jìn)一步對陽性克隆DNA進(jìn)行測序鑒定。根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進(jìn)行篩選：根根據(jù)據(jù)目目的的基基因因特特異異性性表表達(dá)達(dá)進(jìn)進(jìn)行行篩篩選選：：··

·

·

····

·

·

···

·

·

·根據(jù)目的基因特異性表達(dá)進(jìn)行篩選：菌落轉(zhuǎn)膜·

·

·

·菌落轉(zhuǎn)膜菌落轉(zhuǎn)膜菌落轉(zhuǎn)膜雜交雜交雜交雜交根總mRNA探針葉總mRNA探針含目的基因菌落根cDNA文庫葉cDNA文庫根cDNA文庫葉cDNA文庫陰性反應(yīng)克隆子根特異性表達(dá)的目的基因差顯雜交篩選法示意圖D

用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體大腸桿菌酵母菌哺乳動物細(xì)胞各種基因工程受體的特性大腸桿菌：酵母菌：哺乳動物細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO）4

基因工程的操作過程基因工程的操作過程A

DNA的體外重組（切與接）匹配粘性末端的連接EcoR

I5"G

CTTAAG5"

AATTC5"GCTTAA

5"5"G5"AATTC退火5"G

CTTAA5"AATTCGT4-DNA

ligase5"5"GAATTC

CTTAAGGAATTC

CTTAAGGCTTAA5"5"GAATTCG不同粘性末端的連接BamH

I5"5"GGATCC

CCTAGGGGATCC

CCTAGG5"GCCTAGG5"

GATCC5"CTGCA

G5"GACGTC3"T4-DNA

ligaseCGATCC

GCTAGG5"5"GGATCG

CCTAGC5"CTGCAG

GACGTC5"Pst

I3"T4-DNA

pol切平5"C

G5"GCKlenow補(bǔ)平5"GGATC

CCTAG5"

GATCCCTAGGGCTTAA

5"5"5"G5"

AATTCT4-DNA

ligase5"5"EcoR

I

linker5"5"T4-DNA

ligaseGCTTAA5"5"GGAATTCGG5"5"G

AATTC

CTTAA

G平末端的連接－加linkerT4-DNA

ligase5"GGATC

CCTAG5"

GATCCCTAGG5"5"TdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGGGGGGGTTAAGGATCCCCCCCCCTAG退火5"5"GGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGG平末端的連接－加同聚尾5"5"5"

GATCCccccccCTAGG5"粘性末端的更換BamH

I5"5"GGATCC

CCTAGGKlenow補(bǔ)平5"GATCCG5"G

CCTAG5"5"5"5"T4-DNA

ligaseGGATC

CCTAG5"GATCC

CTAGG5"5"5"EcoR

IGGATCGGAATTCCGATCC

CCTAGCCTTAAGGCTAGGGGAATTCC

CCTTAAGGEcoR

I

linkerBamH

I提高載體和外源DNA連接效率的方法：B 重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：適用于革蘭氏陰性菌（如E.coli），原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。電穿孔轉(zhuǎn)化法：噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染：重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞病毒顆粒轉(zhuǎn)染法

磷酸鈣轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)法DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法聚陽離子-DMSO處理轉(zhuǎn)染法顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)病毒顆粒轉(zhuǎn)染法:磷酸鈣轉(zhuǎn)染法：DNA-磷酸鈣哺乳動物細(xì)胞能捕獲粘附在細(xì)胞表面的沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。先將待轉(zhuǎn)染的重組DNA同CaCl2混合，隨后緩慢加入Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣沉淀，粘附在培養(yǎng)的細(xì)胞表面，達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。脂質(zhì)體介導(dǎo)法:重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞影響轉(zhuǎn)化效率的因素：載體及DNA重組分子方面：載體本身的性質(zhì)：載體的空間構(gòu)象：插入片段的大?。菏荏w細(xì)胞方面：轉(zhuǎn)化方法方面：受體細(xì)胞的預(yù)處理：供受體的比例：轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增C

轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）根據(jù)載體標(biāo)記篩選：抗藥性篩選法：ROPROISal

IBamH

ITcrPvu

IPst

IPst

IEcoR

ICla

IHind

IIIHind

IIBal

IAp

rpBR3224363

bpori將外源DNA片段插入BamHI、Sal

I位點(diǎn)：非重組子：Apr、Tcr重組子：Apr、Tcs先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生長、但在Ap+Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子為重組子ApAp+Tc影印挑選操作：顯色篩選法：載體分子上攜帶顏色反應(yīng)標(biāo)記，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）。lacZ"基本操作：目的基因序列檢測：限制性酶切圖譜法DNA雜交法PCR法DNA序列測定1、限制性酶切圖譜法：pUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’ori用BamH

I酶切：重組子：2.7

kb+4.0

kb空載體：2.7

kb如外源DNA片段也是2.7

kb，可用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，通過其長度來鑒定是否為重組子。pUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’oriEcoR

IPst

IpUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’ori4

kSph

IHind

IIIEcoR

I2、DNA雜交法：雜交探針的制備：探針必須滿足下列條件：單鏈結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）足夠長度（至少12

bp）內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū)探針的制備方法和來源：人工合成cDNA合成雜交探針標(biāo)記方法：DNA

pol

I

介導(dǎo)的缺口前移標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記T4-PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記ABC熒光標(biāo)記ABC顯色酶標(biāo)記地高辛系統(tǒng)標(biāo)記1）DNA聚合酶介導(dǎo)的缺口前移標(biāo)記:Mg2+5‘

dNTP5‘

ppp

dA（

-32P-