酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)免疫酶技術(shù)是本世紀(jì)60年代末期發(fā)展起來的一種免疫檢測方法，是目前最廣泛應(yīng)用的標(biāo)記免疫技術(shù)。1966年Nakene和Pierce共同發(fā)表了《酶標(biāo)抗體：制備和抗原定位中的應(yīng)用》，首先提出了免疫酶技術(shù)的基本原理。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表《酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定IgG含量》一文，使免疫酶技術(shù)成為一種實(shí)用的檢測液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的方法。目前免疫酶技術(shù)已廣泛用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)等。由于其具有靈敏度高、試劑穩(wěn)定、設(shè)備簡單、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，近幾年也將其應(yīng)用到食品領(lǐng)域中來檢測某些食品中的生理活性物質(zhì)?；靖拍?、免疫：籠統(tǒng)地概括起來，免疫就是人和動(dòng)物機(jī)體防御、排除外來物質(zhì)(異物)進(jìn)人體內(nèi)，同時(shí)識別和清除體內(nèi)死亡、變性物質(zhì)和平定體內(nèi)叛亂分子突變細(xì)胞，以保護(hù)和穩(wěn)定自身的防護(hù)機(jī)制。2、抗原：抗原是指那些能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏效應(yīng)淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與之特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。3、抗體：是能與相應(yīng)的抗原專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，和機(jī)體其他生物大分子一樣是細(xì)胞的產(chǎn)物，分泌到體液中或表現(xiàn)在細(xì)胞表面上。4、抗原、抗體反應(yīng)：抗原和抗體在體外的反應(yīng)亦稱血清學(xué)反應(yīng)。這類反應(yīng)可借助免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測。抗體定量檢測方法及其原理定量分析抗體的常用方法有擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫吸附法和火箭免疫電泳法等。1、免疫擴(kuò)散法1.1、單向免疫擴(kuò)散法原理：將待檢抗原滴加于含相應(yīng)抗體的瓊脂板小孔中，經(jīng)一定時(shí)間擴(kuò)散后。形成乳白色的沉淀壞，在一定濃度范圍內(nèi)，抗原的含量與沉淀壞直徑成正比。可以先用己知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)測試樣品沉淀環(huán)直徑的大小，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品中抗原的相應(yīng)含量。1.2雙向免疫擴(kuò)散法原理：可溶性抗原與已知可溶性抗體分別加入相鄰的瓊脂糖凝膠板上的小孔內(nèi)，在電解質(zhì)存在下讓它們相互向?qū)Ψ綌U(kuò)散。當(dāng)兩者在最適當(dāng)比例處相遇時(shí)，即形成一條清晰的沉淀線。根據(jù)最大稀釋度與已知標(biāo)準(zhǔn)品最大稀釋度之比，可計(jì)算出抗體含量。2、火箭免疫電泳法原理：抗原在電場力的作用下向前移動(dòng)，當(dāng)抗原在通過含有一定量單一抗體的瓊脂凝膠時(shí)，即形成抗原抗體復(fù)合物，比例合適即沉淀下來。因抗體遷移率低，而抗原隨電泳向前移動(dòng)，因而使抗原、抗體形成圓錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，峰的高度與抗原的濃度呈正比。3、酶聯(lián)免疫吸附法((ELISA)原理：ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測杭原。其基本原理是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）；②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）；③酶作用的底物（顯色劑）。ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個(gè)過程稱為包被，加待測抗體,再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體，生成抗原--待測抗體--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體的量。根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有以下三種類型的常用方法：3.1間接法此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體。加人待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加人酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測定。3.2雙抗體夾心法此法常用于測定抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加人待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加人酶標(biāo)板中。3.3競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體。加入待測抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者竟?fàn)幣c固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。三、酶聯(lián)免疫吸附法測定抗體含量（競爭法）1、儀器設(shè)備酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio－550)；酶標(biāo)板(96孔)；微量注射器。2、試劑(1)HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1:1000，國產(chǎn))；標(biāo)準(zhǔn)牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；(2)包被液：0.05mol/LpH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存,Na2CO30.15g,NaHCO30.293g,蒸餾水稀釋至100mL。(3)稀釋液與洗滌液：0.01mol/LpH7.4PBS--Tween--20,４℃，保存。NaCl8g,KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,Tween—20，0.5mＬ。蒸餾水加至1000m(4)封閉液：含0.1%明膠0.01mol/LPBS，pH7.4。(5)鄰苯二胺底物溶液(臨用前配制)：臨用前將Na2HPO4·12H2O2.9g,檸檬酸0.51g溶于100mL蒸餾水中,再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。(6)終止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸餾水中加入98%濃硫酸76mL混均即可。3、操作方法（1）將抗原結(jié)合在酶標(biāo)板上。取標(biāo)準(zhǔn)IgG（10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋，得到濃度為0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加標(biāo)準(zhǔn)抗原的兩孔為對照，為反應(yīng)的0%值，將反應(yīng)板于4℃過夜（8個(gè)樣品，分3個(gè)平行，4個(gè)100%值孔；共28+2孔）（2）標(biāo)準(zhǔn)牛IgG與初級抗體一兔抗牛血清的反應(yīng)。將標(biāo)準(zhǔn)IgG（10mg/mL）用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀釋好的200μL的兔抗牛血清中，其中4個(gè)不加標(biāo)準(zhǔn)牛IgG作為測量時(shí)的100%值。4℃反應(yīng)過夜。（3）封閉板。將包被好的酶標(biāo)板孔內(nèi)液體傾去，進(jìn)行洗滌，各孔加200μL洗滌液后室溫下放置1min，倒掉，如此重復(fù)4次后，在吸水紙上拍干，加封閉液進(jìn)行封閉，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封閉液）。封閉后，如前述洗滌。（4）向酶標(biāo)板中加人標(biāo)準(zhǔn)抗原和抗體的混合物。將標(biāo)準(zhǔn)牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，同是4個(gè)未加抗原的100%值的平行樣也加入酶標(biāo)板中。37℃放置2h，再洗板4次。（5）加人HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。洗滌后每孔加100μL稀釋好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗滌。（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗處反應(yīng)20min后，每孔加人50μL結(jié)束反應(yīng)液以終止反應(yīng)。（7）吸收測定。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長為492nm下的吸光值。（8）數(shù)據(jù)處理。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以