少孢節(jié)叢孢菌1a分離株的基因序列分析

少孢節(jié)叢孢菌1a分離株的基因序列分析

捕食昆蟲菌有很多種類，但分類非?；靵y。目前其種類鑒定主要取決于分生孢子的形態(tài)結構。Cooke在Drechsler詳細描述捕食線蟲性真菌形態(tài)及捕食特點的基礎上,給出了捕食線蟲性真菌檢索表。在此之后,又發(fā)現(xiàn)了許多新屬,其中有些種是非捕食性的,而后來發(fā)現(xiàn)的這些屬種并未被普遍接受。Schenck等重新修訂了叢孢菌屬(Arthrobotrys),把捕食性作為該屬的一個特點。在研究了分生孢子發(fā)生、孢子形態(tài)、捕食性結構的基礎上,Persson等、Liou等、Ahren等利用分子生物學技術對一些捕食線蟲性真菌18SrDNA及核糖體DNA的ITS片段進行了分子分類學方面的研究。但到目前為止,捕食線蟲性真菌的分類鑒定尚無一個統(tǒng)一標準。本試驗是在傳統(tǒng)的捕食線蟲性真菌分類基礎上,采用現(xiàn)代分子生物學技術對捕食線蟲性真菌的代表種——少孢節(jié)叢孢菌的A1分離株及其相關種屬的18SrDNA基因序列進行了研究,力圖從中得出一些有用的生物信息,從而在分子水平上了解少孢節(jié)叢孢菌不同菌株間是否存在差異及捕食線蟲性真菌的種系發(fā)生關系,比較傳統(tǒng)的形態(tài)分類學與現(xiàn)代分子分類學兩者間的差異,尋求一種較為準確、更符合實際的捕食線蟲性真菌分類方法。1材料和方法1.1來源：蘑菇捕食線蟲性真菌——少孢節(jié)叢孢菌A1分離株,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動科院預防獸醫(yī)學實驗室自我國內(nèi)蒙古地區(qū)分離并保存,經(jīng)傳統(tǒng)分類方法鑒定。1.2食性結構資料捕食線蟲性真菌及相關真菌不同分離株18SrDNA序列有關資料自GenBank下載(表1)。捕食性結構資料來源于Liou等和Ahren等有關文獻。表中1號菌株系我們自己分離的菌株;每個菌株后所標符號表示不同試驗所用的菌株。1.3少斑醇菌a1的分離和提取按常規(guī)酚——氯仿抽提法進行提取。每個樣品加40μlTE(pH8.0)溶解,置-20℃保存。1.4pcr擴增植酸酶基因所用引物根據(jù)Innis,M.A.(1999)所述方法設計,由TaKaRa(大連)寶生物技術公司合成。引物共4對,其堿基順序為:上游引物NS1:5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′,下游引物NS2:5′-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3′;上游引物NS3:5′-GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3′,下游引物NS4:5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′;上游引物NS5:5′-AACTTAAAGGAATTGACGGAAG-3′;下游引物NS6:5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′;上游引物NS7:5′-GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC-3′,下游引物NS8:5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′。擴增產(chǎn)物的長度約分別為597bp、555bp、377bp、310bp。PCR反應體系50μl,其中含10×buffer、dNTP、上下游引物各5μl,Taq酶1μl,DNA模板10μl,雙蒸水24μl。按下列條件進行擴增:94℃初變性4min。50℃退火1min;72℃延伸1min30s;94℃變性1min;循環(huán)30個周期。然后在72℃延伸1min。PCR產(chǎn)物在含有溴化乙錠的1.25%瓊脂糖上電泳,檢測其純度與大小。1.5少藻菌a1的分離，18s的rdna基因研究交由寶生物(大連)技術公司進行測序。每條序列都經(jīng)過正反鏈驗證。1.6真菌18srdna基因序列聚類分析及進化樹的繪制用分子生物學DNASTAR軟件對捕食線蟲性真菌及相關真菌不同分離株18SrDNA基因序列進行聚類分析,并繪制進化樹,對結果進行分析。2結果2.1引物擴增加標少孢節(jié)叢孢菌A1分離株18SrDNA基因可被特異的PCR引物擴增(圖1)。從電泳圖上可以看出,少孢節(jié)叢孢菌A1分離株PCR產(chǎn)物18SrDNA的4個核苷酸片段非常清晰,其大小分別是597bp、555bp、377bp和310bp。2.2基因序列少孢節(jié)叢孢菌A1分離株PCR產(chǎn)物4個核苷酸片段測序后經(jīng)連接,18SrDNA全基因序列為1769bp。2.3a.ol空間性狀asoc的形態(tài)特征用DNASTAR分析軟件進行聚類分析,結果見圖2。從圖中可以看出少孢節(jié)叢孢菌A1分離株(ArthrobotrysoligosporaA1)在進化樹上與A.oligosporavar.oligospora1位于同一個分枝上,二者之間的同源性達到94.7%;與A.oligosporavar.oligospora2不在一個分枝上,同源性為93.1%;相比較而言,少孢節(jié)叢孢菌A1菌株與A.oligosporavar.oligospora1相近。這與二者都具有捕食性結構-粘性菌網(wǎng)(Adhensivenets)的形態(tài)學特點是一致的;而A.oligosporavar.oligospora2僅具有粘性菌絲,無粘性菌網(wǎng)。2.4非食性真菌聚類分析用DNASTAR分析軟件進行聚類分析,結果見圖3?？梢钥闯?16個用于比較的捕食線蟲性真菌分離株和相近的2個非捕食線蟲性真菌分離株在進化樹上很有規(guī)律地按捕食性結構的有無和捕食性結構的不同,分別聚類進行了排列。2.5srdna基因相同測序用DNASTAR軟件對4個屬8個分離株的18SrDNA序列進行了比較,結果表明:4個屬的18SrDNA基因相同序列以majority序列為標準,在768bp、773bp、959bp、1014bp、1015bp、1016bp、1317bp、1460bp、1643bp、1650bp處,每個屬的2個種株該位置堿基相同,不同屬間其中至少1個屬與其它屬在該位置的堿基有明顯差異。2.6叢孢菌18srdna基因核苷酸序列及回復突變試驗用DNASTAR軟件對叢孢菌屬(Arthrobotrys)8個分離株捕食線蟲性真菌的18SrDNA序列進行比較,結果表明:叢孢菌屬8個分離株的18SrDNA基因核苷酸序列,有3個區(qū)域在不同的分離株之間存在較多變異。它們分別是400bp-410bp區(qū)域、1450bp-1475bp區(qū)域及1650bp-1675bp區(qū)域;而在490bp-590bp、880bp-990bp、1030bp-1070bp、1170bp-1210bp幾個區(qū)域基本穩(wěn)定。3天敵優(yōu)勢種的分類傳統(tǒng)的捕食線蟲性真菌分類一般主要取決于分生孢子發(fā)育特點和分生孢子的形態(tài)結構,但是上述這些特征并不穩(wěn)定,在不同的發(fā)育時期,不同的培養(yǎng)條件或重復培養(yǎng)時可能表現(xiàn)不同。近幾年,隨著分子生物學技術的發(fā)展,國外有人試圖尋找另一種分類途徑,這就是利用18SrDNA、5.8SrDNA等來進行捕食線蟲性真菌的分類。18SrDNA基因的保守性較好,進化相對較慢,因此被廣泛用于真核生物的種系發(fā)生關系和進化研究。本試驗是針對捕食線蟲性真菌形態(tài)學分類鑒定中存在的種種缺陷,應用分子生物學的理論和技術,對捕食線蟲性真菌的種類鑒定、種系發(fā)生、分子分類與捕食性結構之間的關系進行探討。試驗結果表明,少孢節(jié)叢孢菌A1分離株(ArthrobotrysoligosporaA1)與同一種的另一來源于瑞典的分離株在進化樹上位于同一分枝上,二者之間的同源性達到了94.7%,而與另一個來源于瑞典的同種分離株不在一個分枝上,同源性為93.1%,這與上述三個株的捕食性結構是一致的。A.oligosporaA1株與A.oligosporavaroligospora1都可產(chǎn)生粘性菌網(wǎng),而A.oligosporavaroligospora2僅產(chǎn)生粘性菌絲。并且從進化樹及同源性比較可以看出,Arthrobotrysoligospora在不同國家、地區(qū)可能存在不同的株,其生物學特性是有差異的。從種系發(fā)生上看,3個少孢節(jié)叢孢菌分離株中,A.oligospora2應是最早,然后是A.oligosporaA1,最后是A.oligospora1。從捕食線蟲性真菌及相關真菌的26個分離株組成的進化樹來看,其中4個屬共18個分離株位于一個大分枝內(nèi)。同一屬的不同分離株不完全聚于相近位置上,這從另一個角度說明傳統(tǒng)形態(tài)學分類方法并不能反映出種系發(fā)生關系,形態(tài)學分類與分子生物學分類存在一定矛盾,應該說后者更能反映生物進化的實際情況。16個捕食線蟲性真菌和2個非捕食線蟲性真菌分離株的聚類分析結果顯示,它們在進化樹上較有規(guī)律地按照捕食性結構的有無和捕食性結構的不同分別聚類進行排列,這與Liou、Ahren所作結果類似,再一次證明了捕食線蟲性真菌的種系發(fā)生與分生孢子發(fā)育特點及分生孢子形態(tài)并不完全相關,而是與捕食性結構關系密切。因此,基于目前的捕食線蟲性真菌分類較為混亂的情況,我們認為如果從簡便實用角度出發(fā),是否可將分子生物學分類所獲得的有關信息與形態(tài)學分類結合起來進行考慮。分類時,可首先將捕食線蟲性真菌與非捕食線蟲性真菌在種屬的位置上分開,然后根據(jù)捕食性結構并結合分生孢子發(fā)育、發(fā)生及形態(tài)特點將捕食線蟲性真菌分屬、分種。當然,如何分類才能更好地反映生物進化、種系發(fā)生的本質(zhì),并充分考慮到現(xiàn)實的可行性和實用價值,尚需進一步探討研究。從捕食線蟲性真菌4個屬、8個分離株18SrDNA基因相應序列的對比來看,在10個堿基位點,每個屬的2個種堿基相同,另外幾個屬中,至少有一個屬在該位點處與其它幾個屬有明顯差異,但同一屬內(nèi)的2個種株堿基相同。由此可以推測是否這些堿基位點決定著屬的差異,但這需要進行更多種屬的比較來加以驗證。另外,從18SrD