第三章高效液相色譜法

第三章高效液相色譜法第1頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較

高速：高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cm·min-1；且采用短柱；在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。例如分離氨基酸，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成.高效：其柱效可達(dá)3萬塔板/米以上（氣相色譜約2000塔板/米），分離效率大大提高了。第2頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2．高效液相色譜法與氣相色譜法的比較（l）氣相色譜法：分析對象僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。高效液相色譜法：分離和分析占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、離子型化合物及摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)。（2）氣相色譜：流動相與組分不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。高效液相色譜法：流動相對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)；第3頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）氣相色譜：在較高溫度下進(jìn)行的，高效液相色譜法：經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作；

高效液相色譜法主要缺點(diǎn):儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格。第4頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月二、影響液相色譜分離的因素液相色譜與氣相色譜的基本概念及理論基本一致，如：保留值，分配系數(shù)，分配比，分離度，塔板理論，速率理論等。但液相色譜流動相為液體，其擴(kuò)散系數(shù)，粘度，密度等與氣體均有很大的差別，因此將對色譜分析過程產(chǎn)生影響。液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同第5頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即：H=A+Cu如圖所示。影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。第6頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月三、提高液相色譜分離效率的措施6、減小柱前柱后死體積；7、改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。1、采用小而均勻的填料，減小dp,

2、減小填料孔穴深度，且孔徑大，以減小流動相滯留傳質(zhì)阻力；3、用低粘度溶劑作流動相4、適當(dāng)降低流動相流速，流速大于0.5cm/s時(shí),H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)；5、適當(dāng)提高柱溫；第7頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月四.高效液相色譜的固定相和流動相

1.高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類：

剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相。硬膠：主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。可承受壓力上限為3.5×108Pa。（－）固定相第8頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月

它的基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。特點(diǎn)：多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。2.固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類：

表面多孔型固定相：第9頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相。特點(diǎn)：顆粒很細(xì)（3～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，最大允許進(jìn)樣量比表面多空型固定相大，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.

全多孔型固定相：第10頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）流動相由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：(1)高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。

(2)低粘度。使用高粘度溶劑，會增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。粘度過于低的溶劑易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.一般溶劑沸點(diǎn)要高于55℃，以便降低其揮發(fā)度。第11頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。也要避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失。(4)溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。(5)

溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，流動相不應(yīng)有紫外吸收。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)最高靈敏度。第12頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月§3－2高效液相色譜儀

InstrumentsofHPLC一.高效液相色譜儀工作過程示意圖第13頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月二.高效液相色譜儀第14頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月三、主要部件高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)四個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng),另有一些輔助裝置：如脫氣、自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。第16頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月

組成：儲液罐、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。其中高壓輸液泵是核心部件高壓輸液泵應(yīng)符合下列要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕。（一）高壓輸液系統(tǒng)

第17頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差。目前主要使用恒流泵，又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。高壓輸液泵第18頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月

梯度洗脫（梯度淋洗）：是通過梯度裝置將兩種（或更多）極性不同的溶劑在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相中溶劑的配比和極性，以提高洗脫能力。類似于氣相色譜程序升溫的作用；優(yōu)點(diǎn)：通過改變極性來改變分離組分的分離因素，以提高分離效果，增加分辨能力，改善峰形，同時(shí)可縮短分離時(shí)間。梯度脫洗裝置內(nèi)梯度外梯度第19頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月上圖表示用二元梯度來分離幾種氨基甲酸酯類殺蟲劑，采用15cm的C18柱，溶劑組成：CH3CN-H2O，15分鐘內(nèi)從10%（v/v）隨時(shí)間改變至50%第20頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置：先由注射器將樣品注入六通閥樣品環(huán)管，再將其轉(zhuǎn)向進(jìn)樣位置第21頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）分離系統(tǒng)——色譜柱一般在分離前備有一個(gè)前置柱，柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相。色譜柱柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅，內(nèi)襯光滑的聚合材料，金屬管用得較多。一般柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。第22頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）檢測系統(tǒng)兩種基本類型的檢測器：溶質(zhì)型檢測器：它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、安培檢測器等。總體檢測器：它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。（l）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）示差折光率檢測器（4）電化學(xué)檢測器第23頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)，應(yīng)用最廣。

特點(diǎn)：靈敏度高；線性范圍寬；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長固定（254nm,280nm)或可變，易于操作；可用于梯度洗脫。

1.紫外檢測器(ultra-violetdetector,UVD)第24頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月光電二極管陣列檢測器(diodarraydetector,DAD)紫外可見光度檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第25頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月第26頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2.熒光檢測器（fluorescentdetector,FD）高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；第27頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月3.示差折光檢測器

（differentialrefractiveindexdetector,DRID）可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；屬于通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；特點(diǎn)：靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；三種類型：偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型；第28頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月4.電化學(xué)檢測器(electrochemicaldetector,ECD)包括：電導(dǎo)、庫侖、伏安及安培檢測器安培檢測器組成：恒電位儀+三電極系統(tǒng)+薄層反應(yīng)池機(jī)理：在一定電位下組分在工作電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)反應(yīng)，而使兩電極間有電流流過。第29頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月§3－3高效液相色譜法的類型及其分離原理

Themainseparatingtype

and

principleofHPLC液固吸附色譜(LSAC)液液分配色譜

（LLPC）化學(xué)鍵合相色譜(CBPC)離子對色譜(IPC)離子交換色譜(IEC)離子色譜(IC)尺寸排阻色譜(SEC)(凝膠色譜法GelC)親和色譜(AC)超臨界流體色譜(SFC)高效液相色譜法類型第30頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月一、液固吸附色譜法

(liquid-solidadsorptionchromatography，LSAC)固定相為固體吸附劑，通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。當(dāng)流動相通過固定相時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代已被吸附的流動相溶劑分子。于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附。

k’值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難以洗脫。試樣中各組分k’差別越大，越有利于彼此分離。1．分離原理第31頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月3．流動相：選擇極性不同的一元或多元溶劑2．固定相一般采用全多孔型硅膠或氧化鋁作為固定相（粒徑<10μm）注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時(shí)間選擇流動相原則:對極性大的組分應(yīng)選用較強(qiáng)極性的流動相溶劑極性強(qiáng)弱用溶劑強(qiáng)度參數(shù)ε°表示注意控制硅膠吸水量，否則LSAC→LLPC第32頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月4．影響k’的因素：與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k’↑，tR↑溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k’↓，tR↓5．出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱6．適用分離對象：非離子化合物、不溶于水的化合物以及幾何異構(gòu)體第33頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。與氣液色譜一樣，固定液是涂漬在擔(dān)體表面；與氣液色譜的不同之處在于，液相色譜的流動相種類對分配系數(shù)有較大的影響。二、液液分配色譜法（liquid-liquidpartitionchromatography，LLPC）及化學(xué)鍵合相色譜(chemicalbondpartitionchromatography，CBPC)1．分離原理第34頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月為了避免固定液的流失。要求流動相盡可能不與固定相互溶，而且兩相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所用流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜；

2、正相分配色譜和反相分配色譜正相色譜——固定相極性>流動相極性

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分反相色譜——固定相極性<流動相極性

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分第35頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月化學(xué)鍵合固定相：是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面，解決固定液在載體上流失問題。它的分離機(jī)理：一般認(rèn)為分配和吸附兩種作用兼有。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。3、化學(xué)鍵合相色譜

特點(diǎn)：鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失；適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k’值范圍寬的樣品；適用于種類繁多樣品的分離。第36頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)組分成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團(tuán)如不同鏈長的烷烴（C8和C18。）和苯基等（2）極性基團(tuán)如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸基等.

（1）鍵合固定相類型第37頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（a）硅酯化（≡Si一OR）鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的鍵合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)：≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20特點(diǎn)：由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。（2）鍵合固定相的制備第38頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)：不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)：格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制pH在4～8范圍內(nèi).（b）≡Si－C或Si一N共價(jià)鍵合固定相

先將硅醇基氯化，再與格氏試劑或有機(jī)鋰反應(yīng)：第39頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（c）硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相特點(diǎn)：具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70℃以下，pH=2～8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛.有機(jī)氯硅烷與硅醇基反應(yīng)第40頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）反相鍵合相色譜法

固定相：極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動相：極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇一水、乙睛一水、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等。適合分離對象：低極性化合物：多環(huán)芳烴等；極性化合物，采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；易離解的樣品：采用水和無機(jī)鹽的緩沖液（離子抑制劑）為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法優(yōu)點(diǎn)：具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰。第41頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）正相鍵合相色譜法固定相：極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面；流動相：非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）；適合分離對象：中等極性不同的化合物、異構(gòu)體，特別適用于分離不同類型的化合物。分離極性化合物時(shí)，組分的分配比k’值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。第42頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月

第43頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月三、離子對色譜法

（ionpairchromatography

IPC）

離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法；離子對色譜機(jī)理：離子對形成機(jī)理；離子交換機(jī)理；離子相互作用機(jī)理；分離原理第44頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對疏水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同；離子對色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。例如離子對形成機(jī)理：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，組分離子A-，加入一種反荷離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負(fù)電的組分離子生成離子對化合物A-B+。第45頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月四、離子交換色譜法

（ion-exchangechromatography

IEC）

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。分離原理：離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。固定相:采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可交換的離子。流動相：具有一定離子強(qiáng)度鹽類的緩沖溶液第46頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月

KX/Y越大，說明X離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，X離子電荷越大，水合離子半徑越小，KX/Y值就越大。待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換：第47頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月五、離子色譜法

（ionchromatographyIC）

機(jī)理：通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。積分儀計(jì)算機(jī)貯液器記錄儀泵樣品注入分離柱抑制柱電導(dǎo)池離子色譜流程圖抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜：離子交換分離柱，抑制柱，電導(dǎo)檢測器，流動相為電解質(zhì)洗脫液。第48頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品為陽離子：用無機(jī)酸作流動相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)：

R+－OH＋H+Cl-→R+－Cl十H2O流動相R+一OH-＋M+Cl-→M+OH－＋R+－Cl-

試樣將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水:消除了流動相本底電導(dǎo)的影響；將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿：OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。樣品為陰離子：流動相為NaOH，經(jīng)抑制柱后，生成了水和樣品陰離子相應(yīng)的酸，H+離子的淌度為Na+離子的7倍，提高了所測陰離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。第49頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2.非抑制型或單柱離子色譜：

采用電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相。克服譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度的缺點(diǎn)。1.采用膜離子抑制器：解決抑制柱的再生問題離子色譜法是水溶液中陰離子分析的最佳方法第50頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月六、尺寸排阻色譜法

（size-exclusionchromatography

SEC）

尺寸（空間）排阻色譜法又稱凝膠色譜法：基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。廣泛應(yīng)用于大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布分析。固定相:為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠過濾色譜（gelfiltrationchromatography,GFC):流動相為水溶液，適合于水溶性樣品分離凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC):流動相為有機(jī)溶劑，適合于非水溶性樣品分離第51頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月

凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后流出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。分離原理：特點(diǎn)：（1）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長；（2）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。第52頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月七、親和色譜法簡介

（Affinitychromatograph

AC）它通常是在載體表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；再連接上配基（酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離的一種方法。第53頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月八、分離類型選擇

choiceofseparationtypes第54頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理

principleandcharacterofSFC1.概述

超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):（1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。§10－4超臨界流體色譜Supercriticalfluidchromatography,SFC第55頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2.超臨界流體的特性在臨界溫度和臨界壓力以上，物質(zhì)是以超臨界流體狀態(tài)存在。即在超臨界狀態(tài)下，隨溫度、壓力的升降，流體的密度會變化。此時(shí)的物質(zhì)既不是氣體也不是液體，卻始終保持為流體。第56頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月超臨界流體的擴(kuò)散系數(shù)和粘度接近于氣相色譜，因此溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以獲得快速高效分離。另一方面，其密度與液相色譜類似，這樣就便于在較低溫度下分離和分析熱不穩(wěn)定性、相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)。（1）性質(zhì)介于液體和氣體之間：具有氣體的低黏度、液體的高密度。第57頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）超臨界流體的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，如擴(kuò)散、粘度和溶劑力等，都是密度的函數(shù)。因此，只要改變流體的密度，就可以改變流體的性質(zhì)，從類似氣體到類似液體。超臨界流體色譜中可通過改變超臨流體的密度（程序升密度）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。第58頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月通常作為超臨界流體色譜流動相的一些物質(zhì)，其物理性質(zhì)列在表中.第59頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月3.SFC的流動相和固定相

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3在SFC中，最廣泛使用的流動相是CO2流體，它無色、無味、無毒、易獲取并且價(jià)廉，對各類有機(jī)分子都是一種極好的溶劑；在紫外區(qū)是透明的；CO2流體允許對溫度、壓力有寬的選擇范圍。

SFC的固定相：用于SFC中的色譜柱可以是填充柱，也可以是毛細(xì)管柱。目前，毛細(xì)管超臨界流體色譜（CSFC）由于具有特別高的分離效率，倍受人們的青睞。通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；第60頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，即增加了溶劑與組分的作用力，k’值下降，洗脫能力增強(qiáng)，淋洗時(shí)間縮短。

CO2流動相，當(dāng)壓力改變：7.0→9.0×106Pa，則：C16H34的保留時(shí)間25min→5min。第61頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月程

序

升

壓第62頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月二、超臨界流體色譜的結(jié)構(gòu)與流程

instrument

structureandthegeneralprocessofSFC1.結(jié)構(gòu)流程

第63頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2.主要部件（1）SFC的高壓泵采用無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計(jì)算機(jī)控制流動相的密度和流量；（2）色譜柱+限流器可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱；具有一根恒溫的色譜柱。這點(diǎn)類似氣相色譜中的色譜柱，目的是為了提供對流動相的精確溫度控制。