通心絡和人參對過度疲勞大鼠血漿代謝組學的影響

通心絡和人參對過度疲勞大鼠血漿代謝組學的影響

代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，在疾病的診斷、病理學、藥理學、植物生理等方面發(fā)揮著廣泛的作用。近幾年來,代謝組學作為一種整體論的研究思路在中醫(yī)中藥方面也獲得了廣泛的關注,希望以此來建立傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代分子藥理學之間的連接。國內已有不少學者在這方面做了嘗試。Li等以糖尿病視網膜病變?yōu)檠芯繉ο?采用代謝組學的方法比較了西醫(yī)根據(jù)疾病發(fā)展階段的分類方法和中醫(yī)根據(jù)證候的分類方法;Yan等通過代謝組學方法研究了淫羊藿中總黃酮的抗衰老作用;Gu等采用基于超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時間質譜儀(UPLCQ-TOFMS)的代謝組學方法研究了黃連素對Ⅱ型糖尿病的療效;Wang等考察了六味地黃丸對甲狀腺素和利血平誘導引起的腎陰虛模型大鼠的治療作用。代謝組學正在越來越多地被應用于中醫(yī)證候的研究和中藥療效的評價。過度疲勞是指由于工作時間過長、勞動強度過大、心理壓力過重導致精疲力竭的亞健康狀態(tài),嚴重時可降低機體健康程度并誘發(fā)其他疾病,如心肌梗塞、內分泌和免疫調節(jié)失調等。在中醫(yī)上,過度疲勞屬于氣虛范疇。通心絡是由人參、水蛭、赤芍等十二味中藥組成的復方中藥,具活血益氣通絡等功效,可用于冠心病心絞痛證屬心氣虛乏、血瘀絡阻者。而人參則是用于補氣、抗疲勞的常用藥物之一。之前作者課題組已經對通心絡在心血管疾病方面(如抑郁-動脈粥樣硬化、內皮功能障礙)的作用做了一些研究,均顯示通心絡可以較好地調節(jié)機體在疾病狀態(tài)下的異常代謝通路。在前期的工作中,我們對過度疲勞(氣虛)大鼠模型進行了血漿和尿液的代謝組學研究,發(fā)現(xiàn)在過度疲勞大鼠體內,精胺、苯丙氨酸、色氨酸、甲基馬尿酸、泛酸、鵝去氧膽酸(CDCA)、丙酰肉堿、丁酰肉堿、1-肉豆蔻-甘油-3-磷酸膽堿(LPCC14∶0)、1-亞油?；?甘油-3-磷酸膽堿(LPCC18∶2)、亮氨酰脯氨酸(leucylproline)、軟木酰甘氨酸(suberylglycine)等代謝物發(fā)生了顯著性變化。本實驗擬進一步從代謝組學的角度考察中藥復方通心絡和人參對過度疲勞大鼠的干預作用。1實驗部分1.1o-20ac柱Shimadzu超快速液相色譜/離子阱-飛行時間質譜聯(lián)用儀(UFLC-IT-TOF-MS,日本島津公司),配有兩個LC-20AD泵、SIL-20AC型自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、CBM-20Alite系統(tǒng)控制器,以及ShimadzuLCMSSolutionVersion3.40工作站。Cenco型渦旋儀,SorvauBiofugeStratos型低溫高速離心機,Labconco型冷凍干燥機。乙腈、甲酸均為色譜純試劑,購自美國Tedia公司。實驗中所用去離子水均經Milli-Q純水系統(tǒng)(MilliporeCorporation,USA)處理。通心絡由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。代謝物的標準品均購自美國Sigma-Aldrich公司。1.2大鼠過度疲勞造模方法動物實驗由河北省中西醫(yī)結合醫(yī)藥研究院設計,大鼠血漿和尿液樣品由該單位提供。清潔級Wistar雄性大鼠每組20只,體重180~200g,共分4組:對照組(采集到的血漿樣品n=13)、過度疲勞組(n=15)、通心絡干預組(0.82g/(kg·d),n=15)、人參干預組(1.2g/(kg·d),n=13)。大鼠籠養(yǎng)在河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理實驗室,光照12h/d,溫度20~23℃,相對濕度40%~60%。大鼠過度疲勞造模方法已在之前發(fā)表的文章中做了詳細描述,現(xiàn)結合通心絡和人參給藥簡單描述如下:過度疲勞模型組大鼠在基礎飲食(每只成年大鼠于靜息狀態(tài)下的進食量,約相當于自身體重的5%)狀態(tài)下在(26±1)℃水溫的自制泳缸(60cm×40cm×100cm)中每日強迫負重(尾部懸掛自身體重5%的重物)游泳兩次,前后相差10min,每次游泳至力竭為止,即:如見大鼠游泳范圍逐漸縮小,動作明顯失調,頭部沒入水面下10s不能上浮則終止游泳;連續(xù)力竭游泳14d至模型建立。通心絡干預組、人參干預組大鼠在進行過度疲勞造模的同時預防灌胃給予相應的藥物。大鼠最后一天游泳后即使用10%水合氯醛麻醉,頸動脈插管采集血液。采集后將血液注入含有30μL10%乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉的離心管里,混勻后在4℃條件下3000r/min離心10min,取上層血漿樣品于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩嶒炛杏捎趥€別動物因麻醉原因死亡或者血漿樣品有溶血現(xiàn)象未進行樣品收集,實際采集到的樣本數(shù)已在上述組別后面標注。1.3lc-ms分析取大鼠血漿200μL,加入800μL乙腈沉淀蛋白,渦旋30s,于4℃靜置10min后,于4℃下15000r/min離心10min。取900μL上清液冷凍干燥,殘渣用180μL80%乙腈復溶,并再于4℃下15000r/min離心10min。取上清液進行LC-MS分析。色譜條件:色譜柱為Shim-packXRODS柱(50mm×2.0mm,2.2μm,日本島津公司)。流動相A:0.1%甲酸-水,流動相B:0.1%甲酸-乙腈。流動相梯度為:0min,2%B;2min,線性變化至15%B;27min,線性變化至65%B;28min,線性變化至98%B。流速:0.3mL/min,柱溫35℃。自動進樣器溫度維持4℃,進樣體積4μL。質譜條件:電噴霧離子源(ESI),采用正、負離子模式同時采集數(shù)據(jù)。霧化氣(nebulizinggas)速率:1.5L/min,干燥氣(dryinggas)壓力:0.15MPa,微通道板(MCP)檢測電壓:1.75kV,離子源接口(interface)電壓:正極4.5kV,負極-3.5kV。曲線脫溶劑管(CDL)和加熱模塊(heaterblock)溫度:220℃,離子累積時間:20ms。掃描范圍:m/z100~1000。1.4差異代謝的篩選LC-MS數(shù)據(jù)文件采用Profilingsolution軟件(日本島津公司)進行峰提取和峰匹配,其主要參數(shù)設置如下:峰寬5s,斜率2000min-1,離子質荷比窗口25mDa,離子保留時間窗口0.3min,離子強度閾值10000counts。所得數(shù)據(jù)矩陣經過對峰面積進行范圍標度化(rangescaled)及80%規(guī)則處理后,導入SIMCA-P(version11.0,Sweden)進行正交偏最小二乘法(OPLS)分析,根據(jù)變量投影重要性(variableimportanceintheprojection,VIP)值結合載荷圖和S-圖來篩選差異代謝物。差異代謝物根據(jù)精確質量數(shù)、多級質譜(MSn)信息及Metlin,Massbank,HMDB等數(shù)據(jù)庫信息進行結構鑒定。2結果與討論2.1檢測大鼠血漿中正、負離子模式下的離子采用ESI+、ESI-切換模式采集大鼠血漿樣品的代謝譜信息。圖1為正、負離子模式下大鼠血漿樣品的典型總離子流(TIC)色譜圖。使用Profilingsolution軟件對LC-MS數(shù)據(jù)進行峰提取和峰匹配,共識別出正、負離子模式下的6138個離子信息。所得數(shù)據(jù)經過數(shù)據(jù)預處理進行下一步模式識別分析。2.2過度疲勞大鼠血漿代謝特征為考察中藥通心絡對過度疲勞大鼠血漿代謝譜的影響,對對照組、過度疲勞組、通心絡干預組3組大鼠數(shù)據(jù)采用Pareto方法進行標度化,并進行OPLS分析,見圖2a~c。在所建立的模型中,計算出1個正交成分和2個偏最小二乘(PLS)成分,表示模型解釋能力的參數(shù)R2Y=0.977,表示模型預測能力的參數(shù)Q2=0.887,說明模型可靠。在圖2a得分圖上,3組大鼠可以得到很好的區(qū)分,表明其血漿代謝譜存在明顯差異。過度疲勞大鼠經通心絡給藥干預后,其血漿代謝輪廓較模型組趨近于正常對照組,表明通心絡干預能夠較好地調節(jié)因過度疲勞而引起紊亂的代謝通路,使之往正常水平變化。根據(jù)變量的重要性(VIP值≥2.3),并結合OPLS模型的載荷圖(圖2b)和S-圖(用來篩選與模型分類相關性最大的代謝物,圖2c),篩選出差異代謝物(載荷圖和S-圖中紅色方框標記的變量為對分類貢獻較大的離子),并鑒定了其中的8個化合物,結果如表1所示,色氨酸、?；悄懰?TCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、脫氧膽酸(DCA)、LPCC18∶2、LPCC16∶0、LPCC18∶1和LPCC18∶0等代謝物對分類起了重要作用。1)validatedwithauthenticstandard;2)identifiedaccordingtotheMS2anddatabases.TCA:taurocholicacid;GCDCA:glycochenodeoxycholicacid;DCA:deoxycholicacid;LPC:lysophosphatidylcholine.VIP:variableimportanceintheprojection.2.3質量分數(shù)和代謝能力為考察人參對過度疲勞大鼠血漿代謝譜的影響,同樣對對照組、過度疲勞組和人參干預組3組大鼠進行OPLS分析(得分圖見圖2d),其中R2Y=0.968,Q2=0.77。過度疲勞大鼠經人參給藥干預后,其血漿代謝輪廓較模型組趨近于正常對照組,表明人參對大鼠整體的代謝通路起到了一定的調節(jié)作用,使之往正常水平變化。結合載荷圖(圖2e)、S-圖(圖2f)和VIP值尋找對分類影響較大的差異代謝物,其中已鑒定的化合物見表2。與通心絡干預類似,色氨酸、膽汁酸、溶血磷脂酰膽堿類等代謝物對分類起了重要作用。1)validatedwithauthenticstandard;2)identifiedaccordingtotheMS2anddatabases.2.4通心絡和人參對過度疲勞的代謝圖3為上述差異代謝物在4組大鼠血漿中的含量比較。在過度疲勞大鼠血漿中,色氨酸、TCA、GCDCA、LPCC16∶0(21.49min)、LPCC18∶0(25.76min)含量均顯著性降低(t檢驗,p<0.05),而DCA、LPCC16∶0(22.19min)、LPCC18∶2、LPCC18∶1、LPCC18∶0(26.42min)含量則顯著性升高(p<0.05)。過度疲勞大鼠經通心絡和人參干預后,OPLS得分圖均顯示其整體代謝輪廓往正常大鼠方向偏移,說明過度疲勞引起紊亂的代謝通路整體上得到了調節(jié),通心絡和人參都可以在一定程度上改善大鼠過度疲勞的狀態(tài)。對比通心絡和人參對各差異代謝物的調節(jié)情況,其中色氨酸、GCDCA、DCA、LPCC16∶0(21.49min)、LPCC16∶0(22.19min)和LPCC18∶0(25.76min)均向正常組大鼠的代謝水平變化,但是TCA則更加偏離正常組大鼠的代謝水平。通心絡和人參對LPCC18∶2和LPCC18∶0(26.42min)的調節(jié)作用相反,通心絡干預下大鼠血漿中的LPCC18∶2和LPCC18∶0(26.42min)向正常組趨近,而人參干預下則更加偏離正常組大鼠的代謝水平。說明兩者對過度疲勞模型大鼠的干預作用有一定的差異,與人參相比,通心絡對過度疲勞引起紊亂的代謝通路的調節(jié)更加全面一些。疲勞是指身體與精神狀態(tài)的下降而導致的周身疲軟、乏力與神疲力竭之感,是機體復雜的生理生化變化的綜合反應,可導致機體神經、內分泌、免疫諸系統(tǒng)調節(jié)失常,在中醫(yī)上屬于氣虛的范疇。色氨酸是神經遞質5-羥色胺合成的前體物質,血漿中的5-羥色胺不能通過血腦屏障,因此中樞的5-羥色胺須在腦內合成,需要游離色氨酸轉運到腦內。研究表明,長時間運動可引起血漿游離氨基酸譜發(fā)生變化,導致游離色氨酸和支鏈氨基酸比值的增加,可能促進游離氨基酸向腦內的轉運和5-羥色胺的生成,進而引起運動疲勞。在通心絡和人參的作用下,大鼠體內的色氨酸水平向正常組大鼠變化,調節(jié)了大鼠體內的色氨酸代謝,可能起到了抗疲勞的作用。此外,疲勞會引起血清中總膽固醇含量的下降,從而可能會影響下游的膽汁酸代謝。過度疲勞引起的大