實(shí)驗(yàn)四 DNA的瓊脂糖凝膠電泳

龍志敏20093022012109制藥一班實(shí)驗(yàn)四DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。2、學(xué)習(xí)凝膠成像系統(tǒng)的使用。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA片段的常用技術(shù)，適用于大小在0.2kb～50kb范圍內(nèi)的DNA片段的分離。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測。相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對可以提供一個(gè)用于確定DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)，其分子可插入DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254～365nm波長紫外光照射下，呈桔紅色熒光，因此可對分離的DNA進(jìn)行檢測。由于EB具有強(qiáng)致癌作用，現(xiàn)已逐漸改用EB替代染料，如GelRed、SYBRGreen、Goldview等。三、儀器及試劑1、儀器及耗材水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、100mL或250mL錐形瓶、量筒、吸頭等2、試劑（1）50×TAE緩沖液(2MTris-乙酸，0.05MEDTA)：稱取60.5gTris，用雙蒸水?dāng)嚢枞芙?，加?4.3mL冰乙酸和25mL0.5MEDTA(pH8.0)，并定容至250mL，高壓滅菌，室溫保存。（2）6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油（3）溴化乙啶或EB替代物、低熔點(diǎn)瓊脂糖四、操作步驟1、用1×TAE配0.8%瓊脂糖凝膠液，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成0.8%瓊脂糖凝膠液，加入EB替代染料（每100mL凝膠溶液加染料10μL）。2、膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，將內(nèi)槽置于匹配的制膠模具中，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。3、加樣：取10μLDNA樣品于1.5mL離心管中，加入適量上樣緩沖液，混勻（上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1×）。用10μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60~100V，樣品由負(fù)極向正極方向移動(dòng)。5、觀察照相：結(jié)束電泳，取出凝膠模具，將凝膠推到凝膠成像系統(tǒng)的玻璃板上。打開紫外燈下，DNA存在則顯示出綠色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。五、常見問題及注意事項(xiàng)1、配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。2、瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時(shí)要輕緩。3、瓊脂糖凝膠的配制及使用時(shí)應(yīng)帶一次性塑料手套，并在實(shí)驗(yàn)室專門的實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)使用。4、紫外線對人體有損傷作用，開燈時(shí)間不宜太長，注意防護(hù)。六、思考題結(jié)合電泳檢測結(jié)果（DNA條帶的大小和分布）,討論