不同熱處理方法對(duì)脂肪氧合酶酶活力的影響

不同熱處理方法對(duì)脂肪氧合酶酶活力的影響

脂肪氧化酶（ec1.13.1:13）是氧化還原酶，可誘導(dǎo)順-順-1和四-戊二醇的飽和脂肪酸和酯形成氫氧化反應(yīng)。生成的氫氧化反應(yīng)具有很高的反應(yīng)能力，可以影響食品中的不同成分。初期產(chǎn)物氫過(guò)氧化物及其反應(yīng)中形成的各種次級(jí)產(chǎn)物的存在會(huì)給食品的顏色、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)等方面帶來(lái)正面或負(fù)面的影響.僅以含脂肪氧合酶活力最高的大豆為例,一方面,脂肪氧合酶催化脂肪氧化生成的n-己醛和n-戊醛是形成豆腥味的主要成分,而且脂肪氧合酶催化反應(yīng)的初期產(chǎn)物——?dú)溥^(guò)氧化物可與大豆蛋白中的——SH反應(yīng)生成—S—S—鍵、—SO2H或—SO3H,從而使大豆蛋白形成凝膠的能力下降;另一方面,將少量含有脂肪氧合酶活力的大豆粉加入面粉中,生成的氫過(guò)氧化物在降解色素、漂白面粉的同時(shí)還氧化面筋蛋白質(zhì)形成二硫鍵,起到漂白面粉和提高焙烤質(zhì)量的作用.鑒于脂肪氧合酶對(duì)食品質(zhì)量的多重影響以及含脂肪氧合酶活力最高的大豆作為優(yōu)良蛋白質(zhì)資源在食品工業(yè)中日益廣泛的應(yīng)用,有必要尋找到快速、準(zhǔn)確、靈敏的脂肪氧合酶測(cè)定方法,以便于食品加工過(guò)程中控制與脂肪氧合酶有關(guān)的質(zhì)量指標(biāo).目前為止,已公開(kāi)報(bào)道的測(cè)定方法包括量壓法、分光光度法、氧電極法和Fe(CNS)3顯色法,各種方法的測(cè)定原理和測(cè)定參數(shù)不同,具有各自不同的優(yōu)缺點(diǎn).氧電極法的工作原理是通過(guò)測(cè)定恒溫密閉體系中氧電極電位的變化,定量脂肪氧合酶催化底物亞油酸發(fā)生氧合反應(yīng)所消耗的氧氣,并以初始耗氧速度作為酶活力單位.這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可連續(xù)記錄反應(yīng)進(jìn)程,適用于純酶和粗酶提取液的動(dòng)力學(xué)研究,但由于對(duì)儀器溫控和密閉性要求苛刻,限制了此法的廣泛使用.Fe(CNS)3顯色法是利用酶反應(yīng)初期產(chǎn)物能氧化Fe(CNS)2生成有色化合物的特性,采用分光光度法定量測(cè)定酶活力,該法存在的主要問(wèn)題是Fe(CNS)3不穩(wěn)定,而且呈現(xiàn)的色值和Fe(CNS)3的量之間缺乏良好的線(xiàn)性關(guān)系.因此,作者將討論除上述兩種方法以外的其它脂肪氧合酶活力測(cè)定方法,簡(jiǎn)要介紹量壓法、分光光度法及未公開(kāi)發(fā)表的KI-淀粉法的基本原理,著重比較各種方法的相關(guān)性及其優(yōu)缺點(diǎn),探討每種方法的適用范圍.1材料和方法1.1材料表面大豆東北產(chǎn);亞油酸、KI、可溶性淀粉、冰醋酸及其它試劑均為分析純.1.2瑞利分析公司的紡粘設(shè)備UV-1100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),北京瑞利分析儀器公司;微量呼吸減壓儀,上?？萍即髮W(xué)產(chǎn)品;722光柵分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠(chǎng)產(chǎn)品.1.3方法1.3.1脂質(zhì)酶的制備全脂大豆經(jīng)粉碎后用石油醚多次浸提得到脫脂大豆粉.稱(chēng)取10g脫脂大豆粉加水?dāng)嚢枋蛊涑浞秩芙獠⒍ㄈ葜?00mL,所得溶解液在4℃,6000r/min條件下離心20min,得上清液為酶液.1.3.2熱處理酶將提取得到的酶液移入數(shù)支小試管中,用薄膜封口,然后將試管置于70℃的水浴中進(jìn)行熱處理,每間隔一定時(shí)間取出一管并迅速放入冰浴中冷卻至0℃左右,即得到經(jīng)2～20min熱處理的各個(gè)酶液樣品.1.3.3酶活性測(cè)定1單次最佳添加量ld50取0.4mL酶液(已用蒸餾水稀釋10倍后的酶液)放入反應(yīng)瓶的側(cè)臂內(nèi),再取1.0mL底物乳狀液(5mL亞油酸+2mL吐溫-20+15mL蒸餾水,攪拌而成)和2.0mL磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH6.5)放入主室中.反應(yīng)瓶在30℃的恒溫水浴中振動(dòng)平衡5min后關(guān)閉測(cè)壓計(jì)活塞,調(diào)整密閉端液面至參比點(diǎn),將側(cè)臂內(nèi)容物倒入主室并記時(shí),反應(yīng)3min后調(diào)測(cè)壓計(jì)密閉端的液柱到原來(lái)的參比點(diǎn),立即讀出開(kāi)口端的液柱高度,同時(shí)使用溫壓計(jì)校正.以1min內(nèi)消耗氧1μL作為一個(gè)酶活力單位(U1).2響應(yīng)面法l/l取0.3mL酶液(已用蒸餾水稀釋50倍后的酶液)于試管中,加入2mL底物乳狀液(2.24×10-3mol/L亞油酸分散于含0.5μL/mL吐溫-20的0.1mol/L、pH9.0的硼酸緩沖液中)混勻后放入30℃水浴中并開(kāi)始計(jì)時(shí),反應(yīng)3min后加入5mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng),然后加入5mL蒸餾水混勻并測(cè)定反應(yīng)液的吸光度.以1min內(nèi)3mL反應(yīng)體系在234nm的吸光度增加0.001作為一個(gè)酶活力單位(U2).3反應(yīng)時(shí)間及用量的確定取0.2mL酶液(已用蒸餾水稀釋10倍后的酶液)于試管中,加入2mL底物乳狀液(0.03mol/L亞油酸分散于含10μL/mL吐溫-20的水中,調(diào)pH值至9.0)并開(kāi)始計(jì)時(shí),于30℃水浴中反應(yīng)4min后加入0.1mL,1%的可溶性淀粉、0.4mL飽和KI溶液(新鮮配制)和5mL15%的醋酸溶液.室溫下顯色并測(cè)定顯色8min時(shí)體系的吸光度,以1min內(nèi)3mL反應(yīng)體系在470nm的吸光度增加0.001作為一個(gè)酶活力單位(U3).上述3種方法均遵循文獻(xiàn)報(bào)道的基本步驟,并根據(jù)實(shí)際酶活力對(duì)具體條件加以修正,實(shí)驗(yàn)選用的酶液稀釋倍數(shù)、酶和底物加量均經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)確證,在測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi),底物過(guò)量條件下,測(cè)定參數(shù)隨反應(yīng)時(shí)間呈線(xiàn)性增加.2ki-淀粉法與量壓法的比較量壓法的測(cè)定原理與氧電極法相似.脂肪氧合酶催化底物亞油酸與氧結(jié)合形成氫過(guò)氧化物,使得一定體積的密閉體系內(nèi)氧氣的量減少,在溫度恒定的條件下,體系的氣體總壓下降.根據(jù)密閉體系的總氣體體積和測(cè)定得到的氣體壓力變化值,運(yùn)用氣體狀態(tài)方程就可以計(jì)算出反應(yīng)的耗氧量.耗氧量與酶反應(yīng)強(qiáng)度線(xiàn)性相關(guān).該法的主要優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定參數(shù)與反應(yīng)體系濁度無(wú)關(guān),因而既適用于純酶也適用于粗酶酶活力的測(cè)定,但由于測(cè)定時(shí)需不斷振動(dòng)反應(yīng)瓶以保持底物的乳化和溫度的恒定,酶活力會(huì)因振動(dòng)而部分損失.與量壓法不同,分光光度法測(cè)定的是酶催化反應(yīng)的初期產(chǎn)物.脂肪氧合酶催化底物亞油酸反應(yīng)生成的初期產(chǎn)物具有共軛二烯的結(jié)構(gòu),而共軛雙鍵在234nm處有特征吸收,通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系在234nm處的吸光度可以定量生成的共軛二烯量,并推算出酶活力.該法的顯著優(yōu)點(diǎn)是可連續(xù)測(cè)定,但受分光光度法測(cè)定體系不能有濁度的限制,不適用于濁度較高的粗酶液酶活力的測(cè)定,比如未脫脂的大豆提取液.KI-淀粉法與Fe(CNS)3顯色法類(lèi)似,測(cè)定的基本原理是基于脂肪氧合酶催化亞油酸反應(yīng)形成的氫過(guò)氧化物在酸性條件下可氧化I-形成I2,而I2與淀粉結(jié)合可呈現(xiàn)出介于蘭、紫和褐色之間的顏色,在470nm處有特征吸收.吸光度的大小直接反映生成的I2量,因而可以間接定量脂肪氧合酶酶活力的大小.與上述分光光度法一樣,KI-淀粉法的測(cè)定同樣受到酶液濁度的制約,而且由于顯色是在酸性條件下進(jìn)行的,酶液中存在的蛋白質(zhì)和脂肪在酸性條件下會(huì)絮凝,若采用離心的方法雖能除去絮凝但同時(shí)會(huì)使部分有色物質(zhì)的沉淀,從而影響測(cè)定結(jié)果的可靠性.因此,該法不適合于粗酶提取液酶活力的測(cè)定.以上簡(jiǎn)要地分析了3種方法的優(yōu)缺點(diǎn),采用上述3種方法測(cè)得的酶提取液及經(jīng)熱處理后的酶液的酶活力數(shù)據(jù)見(jiàn)表1～3.從表中數(shù)據(jù)可以看出,對(duì)于相同的酶液,欲使測(cè)定參數(shù)處于較為理想的范圍,分光光度法的酶液稀釋倍數(shù)最高,在本實(shí)驗(yàn)中為50倍,比采用量壓法和KI-淀粉法時(shí)的稀釋倍數(shù)高4倍,也就是說(shuō),分光光度法的靈敏度最高.但從工業(yè)化的角度來(lái)看,由于KI-淀粉法的測(cè)定是在可見(jiàn)光范圍進(jìn)行的,當(dāng)有脂肪氧合酶酶活力存在時(shí),測(cè)定體系就會(huì)呈現(xiàn)肉眼可辨的特征顏色,因而該法特別適用于滅酶時(shí)鑒定是否存在脂肪氧合酶的殘余酶活力,即脂肪氧合酶的定性分析.雖然分光光度法與量壓法的測(cè)定參數(shù)不同,但兩個(gè)測(cè)定參數(shù)之間存在著一定的數(shù)學(xué)關(guān)系.根據(jù)234nm的吸光度和亞油酸氫過(guò)氧化物(共軛二烯)的摩爾消光系數(shù),可以推算出被氧化的亞油酸的量,并相應(yīng)地計(jì)算出反應(yīng)的耗氧量.由分光光度法的酶活力定義,每mL酶液催化反應(yīng)1min,在3mL體系內(nèi)A234為U2×0.001,相當(dāng)于1L的體系內(nèi)A234=U2×0.001×3/1000=U2×3×10-6,即生成的氫過(guò)氧化物為U2×3×10-6/(2.74×104)mol=U2×1.09×10-10mol,換算成耗氧量即為U2×2.44×10-3μL.計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4.表中數(shù)據(jù)顯示,采用分光光度法測(cè)定的結(jié)果高于量壓法,據(jù)分析,可能是由于采用量壓法時(shí)平衡階段和酶反應(yīng)時(shí)的振動(dòng)會(huì)造成酶活力的部分損失,也可能存在測(cè)量的系統(tǒng)誤差.不過(guò)總的來(lái)說(shuō),計(jì)算的結(jié)果證實(shí)了兩種測(cè)定方法的可靠性.比較幾種方法測(cè)定得到的殘余活力,可以考察KI-淀粉與其它兩種方法的相關(guān)性.根據(jù)表1～3中的數(shù)據(jù),將殘余活力對(duì)熱處理時(shí)間作圖(圖2),圖中曲線(xiàn)再次證明量壓法與分光光度法的良好相關(guān)性.相對(duì)而言,KI-淀粉法的曲線(xiàn)波動(dòng)較大,這有可能是加入醋酸終止酶反應(yīng)和顯色時(shí),在酸性條件下體系濁度較大所帶來(lái)的