免疫耐受的免疫應答與抗原提呈細胞的作用

免疫耐受的免疫應答與抗原提呈細胞的作用

經(jīng)典免疫藥物被定義為對身體的識別“本身”和“而不是自身”，并具有回答的生理功能。因此,機體如何識別“自己”和“非己”被認為是免疫學的核心問題。Burnet于上世紀50年代末提出抗體生成的克隆選擇學說,其要點為:體內(nèi)存在隨機形成的多樣性免疫細胞克隆,每一克隆的細胞均表達同一特異性受體;抗原進入體內(nèi)后,選擇表達特異性受體的免疫細胞與之反應,致該細胞克隆擴增,產(chǎn)生大量后代細胞,它們可合成大量具有相同特異性的抗體。該學說對免疫耐受的形成提出如下解釋:胚胎期個體免疫系統(tǒng)與自身抗原接觸,自身抗原特異性細胞克隆可被清除或處于禁閉狀態(tài),使成年個體喪失對“自身”抗原的反應性,從而產(chǎn)生自身耐受。基于克隆選擇學說而提出的“自己-非己(self-nonself,SNS)”模式(圖1a)將免疫識別的主體限定為特異性免疫細胞,即T細胞和B細胞。但其后的研究發(fā)現(xiàn),T、B細胞活化還有賴于協(xié)同刺激信號(co-stimulatingsignal),SNS理論無法解釋此現(xiàn)象。Janeway基于Toll樣受體(Tolllikereceptor,TLR)被發(fā)現(xiàn),于1989年提出模式識別理論(pattern-recognitiontheory),其要點為:適應性免疫應答中,抗原提呈細胞(APC)表面的模式識別受體(pattern-recognitionreceptor,PRR)可識別病原體攜帶的“病原相關分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern,PAMP)”,繼而向特異性免疫細胞提供雙信號并使之激活;“非感染的自己”,由于不攜帶PAMP而不能啟動適應性免疫應答。因此,APC是參與免疫識別的主體,其在適應性免疫應答中承擔“分揀信號”的作用。上述“感染-非己(infectious-nonself,INS)”模式(圖1b)可解釋感染免疫等諸多免疫學現(xiàn)象,但顯然不適用創(chuàng)傷和自身免疫所致的無菌性炎癥。Matzinger汲取“模式識別理論”的合理內(nèi)涵,于1994年提出危險模式理論(dangermodeltheory)(圖1c),其要點為:APC通過PRR而識別組織損傷或炎癥反應所產(chǎn)生的“危險信號”,微生物及其代謝產(chǎn)物共有的PAMP是主要的外源性危險信號。其后發(fā)現(xiàn),機體組織損傷時可產(chǎn)生某些內(nèi)源性危險信號,又稱警報素(alarmin),包括高遷移率族蛋白B1(highmobilitygroupproteinbox1protein,HMGB1)、熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)、抗菌肽/防御素、透明質(zhì)酸、氧自由基、神經(jīng)介質(zhì)和某些細胞因子等。外源性PAMP和內(nèi)源性警報素統(tǒng)稱為危險相關分子模式(danageassociatedmolecularpattern,DAMP)。1hmgb1總結(jié)1.1hgmb2、hagb3的組成高遷移率族蛋白(HMG)屬核內(nèi)蛋白,因在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中具有高遷移能力而得名,其包括HMGA、HMGB、HMGN三個家族。HMGB家族含HMGB1、HMGB2、HMGB3三個成員。其中,HMGB1是唯一可釋放至胞外并具有細胞因子活性的分子。HMGB1在進化過程中高度保守,在所有哺乳動物中有99%同源性。HMGB1分子含與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域A盒(aa1～79)和B盒(aa89～163),及1個高度重復并富含酸性氨基酸的C末端(aa186～215)(圖2)。其中,B盒前20個氨基酸是其發(fā)揮細胞因子活性的關鍵位點。A盒蛋白(A-box)能取代全長HMGB1而與相應受體結(jié)合,但不發(fā)揮生物學效應,故純化的A-box可作為HMGB1特異性拮抗劑。1.2各組大鼠合成激素的作用HMGB1組成性表達于各種組織細胞胞核內(nèi),其功能為:①使雙螺旋極度扭曲以便各種轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)相互作用;②調(diào)節(jié)類固醇激素受體、NF-κB、p53及RAG1重組酶的轉(zhuǎn)錄活性;③與組蛋白作用而影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu),使染色質(zhì)解螺旋。HMGB1非特異性與DNA結(jié)合,可通過核孔而穿梭于胞核與胞漿之間。細胞分裂中期,HMGB1可從濃縮的染色體上分離并擴散至胞漿中,表明其與染色質(zhì)呈不穩(wěn)定結(jié)合。1.3hmgb1是基因的來源1.3.1hgmb1與tnf-的關系HMGB1可由壞死細胞被動釋放。研究顯示:①將凋亡的野生型成纖維細胞加入巨噬細胞培養(yǎng)體系后不能誘生TNF-α;②將壞死的野生型成纖維細胞加入巨噬細胞培養(yǎng)體系,可誘導大量TNF-α生成;③加入HMGB1基因缺陷的壞死成纖維細胞,僅能引起極低水平TNF-α生成。以上結(jié)果均表明HMGB1屬內(nèi)源性危險信號,其在壞死所致炎癥反應中發(fā)揮重要作用。凋亡細胞中HMGB1仍保留于核內(nèi),此與凋亡過程中組蛋白去乙酰化相關。HMGB1與DNA的親合力取決于組蛋白乙?；潭?組蛋白乙?；潭仍降?HMGB1與DNA的結(jié)合能力越強;用去乙酰化的抑制劑trichstatinA阻止凋亡細胞染色質(zhì)去乙?；?則凋亡細胞不再保留HMGB1而成為炎性的凋亡細胞。1.3.2誘導巖型hgmb1的誘導表達PAMP、某些細胞因子(IFN-γ、IL-1、TNF-α等)和細胞應激等因素均可誘導DC和單核/巨噬細胞等主動分泌HMGB1(圖3)。體內(nèi)外實驗證實:LPS刺激巨噬細胞8h后,HMGB1分泌即增加;內(nèi)毒素源性全身感染早期,TNF-α刺激的巨噬細胞能主動分泌HMGB1;多種炎癥刺激可誘導單核/巨噬細胞主動分泌HMGB1,但后者的產(chǎn)生遲于TNF-α、IL-1β釋放,并經(jīng)歷12～18h的對數(shù)期。HMGB1缺乏引導肽,不能循經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體途徑分泌,而是通過一種特殊的細胞器(即分泌性溶酶體)而分泌。HMGB1分泌的起始階段有賴于LPS、IL-1β、TNF-α等提供單核細胞炎癥信號,后者可使HMGB1分子27～43和178～184位賴氨酸殘基乙?；?導致其核定位信號區(qū)無法結(jié)合核轉(zhuǎn)位蛋白,使之在胞漿內(nèi)聚集而不能再進入核內(nèi)。另外,HMGB1亦可通過磷酸化和甲基化而被分泌。已發(fā)現(xiàn),PAMP和細胞因子刺激巨噬細胞分泌HMGB1的機制各異,例如:LPS通過促進HMGB1分子乙?；{(diào)節(jié)其分泌;TNF-α則通過使HMGB1磷酸化,促進其進入胞漿而被分泌。除多種藥物外,HSP72(亦屬警報素)也能抑制HMGB1釋放。過表達的HSP72與HMGB1在核內(nèi)相互作用,可抑制LPS、TNF-α和氧化應激誘導巨噬細胞分泌HMGB1的效應。2非hmgb1的功能和機制2.1rage和tlr4在細胞水平分布中的表達HMGB1的受體釋放至胞外的HMGB1可通過其B盒與相應受體結(jié)合,從而發(fā)揮多種生物學效應。胞外HMGB1的受體包括糖基化終產(chǎn)物受體(advancedglycationendproduct,RAGE)和TLR。2.1.1RAGE為跨膜蛋白,屬免疫球蛋白超家族成員,廣泛表達于多種細胞表面,通過與糖基化終產(chǎn)物(AGE)、β-淀粉樣肽、雙性素等配體相互作用,參與糖尿病、炎癥及腫瘤等病理過程。RAGE僅低表達于正常組織,而在其配體聚集部位高表達。HMGB1與RAGE結(jié)合可激活NF-κB,從而誘導趨化因子和細胞因子產(chǎn)生,并參與免疫細胞成熟、遷移和表面受體表達。2.1.2TLR4、TLR2HMGB1與LPS介導TLR4活化的機制不同,體外實驗發(fā)現(xiàn):HMGB1可活化IKKα和IKKβ,但LPS僅活化IKKβ;經(jīng)HMGB1與LPS處理的細胞,MAPK蛋白活化與細胞因子產(chǎn)生也不盡相同。2.2非hmgb1基因的功能2.2.1hgmb1在肝臟熱缺血-再灌注(I/R)模型中,HMGB1可充當早期炎癥介質(zhì)而發(fā)揮重要作用。再灌注1h時HMGB1蛋白表達即上調(diào),并呈時間依賴性而上升,至24h達高峰。2.2.2hgmb1為晚期炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用在關節(jié)炎、膿毒血癥、創(chuàng)傷、急性肺損傷等急慢性疾病中,胞外HMGB1的出現(xiàn)滯后于早期炎癥因子TNF-α和IL-1β,從而作為晚期炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn):給鼠注射LPS或TNF后8～32h,血清中可檢出HMGB1;巨噬細胞與HMGB1共孵育,能提高TNF-αmRNA表達水平并促進其重新合成;對LPS敏感或LPS耐受的小鼠腹腔注射rHMGB1,均可致死。以上結(jié)果提示:早期炎性刺激可誘導HMGB1釋放;HMGB1也能誘生其他炎癥介質(zhì),從而在晚期炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。2.2.3參與適應性免疫反應2.2.3.不同途徑誘導細胞d①HMGB1及其截短形式B盒均可上調(diào)人單核細胞來源的DC表達CD83、CD54、CD80、CD40、CD58及MHCII類分子等,并促使其分泌IL-12、IL-6、IL-1、IL-8、TNF-α及RANTES等促炎細胞因子;②HMGB1能促使DC從CCL5敏感(未成熟表型)轉(zhuǎn)變?yōu)閷CL21敏感(成熟表型),從而有利于DC遷移至次級淋巴結(jié);③HMGB1本身是未成熟DC(而非成熟DC)的趨化因子;④混合淋巴細胞反應中,B盒刺激的DC可誘導同種T細胞分泌IL-2和IFN-γ,并分化為Th1細胞;⑤給予抗HMGB1中和抗體、A-box或抗RAGE抗體,可使成熟DC表面CD80、CD83和CD86表達上調(diào)受阻,并對DC分泌IL-12、克隆擴增和na?veT細胞存活顯示抑制作用。2.2.3.2.hmg1直接影響t和b細胞①成熟的DC通過分泌HMGB1而促進CD4+T細胞增殖、生存和分化為Th1細胞;②HMGB1參與自身反應性B細胞活化。3參與多種免疫病理事件,作為危險信號激活apcHMGB1可直接介導非特異性炎癥反應,也可作為內(nèi)源性危險信號激活APC,從而啟動、增強適應性免疫應答,并參與多種免疫病理過程發(fā)生和發(fā)展。3.1hgmb1抗體HMGB1在關節(jié)炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用,相關依據(jù)為:①類風濕關節(jié)炎患者血清中可檢出抗HMGB1抗體;②人類滑膜炎及實驗性滑膜炎中,胞漿和胞外均出現(xiàn)HMGB1異常表達;③關節(jié)內(nèi)注射重組HMGB1可引起小鼠中度滑膜炎,而HMGB1拮抗劑能有效減輕膠原誘導的關節(jié)炎。3.2抗hagb1基因缺陷小鼠肝胰腺及肝臟功能性狀的變化HMGB1參與多種器官(如肝、腎、大腦和心臟等)缺血再灌注損傷(I/R)。肝熱缺血再灌注損傷中,HMGB1充當啟動炎性反應的角色,例如:①缺氧后1h,肝細胞中HMGB1表達即明顯增高,并維持于較高水平直至24h后,在缺血前給予抗HMGB1多克隆抗體預處理,小鼠肝I/R損傷明顯減輕;②與野生型小鼠(C3H/HeOuj)相比,TLR4基因缺陷小鼠(C3H/Hej)肝缺血再灌注損傷較輕;③重組的HMGB1或抗HMBG1中和抗體對TLR4基因缺陷小鼠的肝缺血再灌注損傷并無明顯影響,提示TLR4作為HMGB1的受體,在相關病理過程中發(fā)揮重要作用。3.3hgmb1與腫瘤幾乎所有腫瘤(尤其是上皮細胞源性腫瘤)均出現(xiàn)HMGB1表達上調(diào)。壞死的腫瘤細胞可釋放HMGB1,在腫瘤微環(huán)境中介導慢性炎癥,有利于腫瘤存活、生長與轉(zhuǎn)移。另外,HMGB1在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,故HMGB1升高是前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等預后不良的指標。與此相反,動物實驗中放、化療的療效有賴于HMGB1-TLR4信號通路,并發(fā)現(xiàn)來源于腫瘤細胞的HMGB1可招募和活化嗜酸粒細胞。3.4糖尿病i1例，t1d本課題組獲如下發(fā)現(xiàn):3.4.1caspase抑制劑①不同方法(IL-1β/TNF-α/IFN-γ、紫外線、喜樹堿)所誘導的NIT細胞和原代胰島細胞凋亡,均可被動釋放HMGB1,此效應可被Caspase抑制劑Z-VAD-FMK所阻斷;②LPS刺激的NOD小鼠DC和胰島浸潤的免疫細胞均能主動分泌HMGB1;③重組HMGB1能促進NOD小鼠DC成熟和巨噬細胞活化;④用抗HMGB1中和抗體(600μg/鼠)處理8周齡和12周齡NOD小鼠I型糖尿病模型,至25周可顯著降低糖尿病發(fā)病率并延緩發(fā)病時間。3.4.2小鼠apc含量的檢測①抑制HMGB1所致DC成熟;②減少胰腺淋巴結(jié)(pancreaticlymphnode,PLN)CD11c+CD11b+DC(可能是向自身反應性T細胞提呈抗原的APC)比例;③增加小鼠PLNCD4+Foxp3+Treg比例;④增加PLNCD8+IFN-γ+T(Tc1)細胞比例。但是,阻斷HMGB1對T細胞活化似乎并無明顯影響。3.5gst-a治療慢性排斥反應的機制本課題組發(fā)現(xiàn):①小鼠同種腹部異位心臟移植模型(BALB/c-C57BL/6)術后1d,其心臟移植物HMGB1mRNA表達即升高,且TNF-α表達亦上調(diào);②移植后3d,HMGB1表達持續(xù)上升,術后7d表達水平達到高峰;③冷缺血1h的心臟組織可被動釋放HMGB1,移植后7d移植物局部免疫細胞可主動分泌HMGB1;③HMGB1特異性拮抗劑GST-Abox處理受者小鼠,可使移植心臟存活時間明顯延長,并伴隨HMGB1和TNF-α表達下調(diào),移植物浸潤淋巴細胞減少。上述結(jié)果提示:同種器官移植中HMGB1表達上調(diào),通過介導T細胞應答而參與移植排斥反應。GST-Abox重組蛋白抗排斥反應的機制可能為:①抑制LPS誘導的DC成熟;②影響抑制T細胞極化,使脾臟Tc1細胞明顯減少;③下調(diào)移植物表達HMGB1和炎癥性細胞因子TNF-α、IFN-γ。3.6參與hgmb1和其他疾病的檢測本課題組發(fā)現(xiàn):HMGB1與異種移植排斥反應、免疫性肝損傷等發(fā)生密切相關(未發(fā)表資料):①異種心臟移植模型中HMGB1表達升高,抗HMGB1中和抗體能延長移植物存活時間;②ConA所致肝損傷小鼠模型中,HMGB1表達增加,抗HMGB1中和抗體能減輕組織損傷。文獻還報道:HMGB1作為重要的炎性細胞因子,可參與膿毒血癥、創(chuàng)傷、急性肺損傷等疾病發(fā)生和發(fā)展。HMGB1與CpG復合物能啟動TLR9-MyD88通路,促進漿細胞DC(plasmacytoi