蟲草素的研究進展

蟲草素的研究進展

草地昆蟲素，也被稱為草地昆蟲素、飼料草細菌素和3'-脫氧酶（3'-deoxydeoxyme），是第一個從真菌中分離出來的抗凝酶素。早在1950年,Cunninghametal.(1950)觀察到被蛹蟲草Cordycepsmilitaris寄生的昆蟲組織不易腐爛,進而從中分離出一種抗菌性物質,定名為蟲草素,并在Nature上發(fā)表,之后許多學者對其進行了驗證研究(Kaczkaetal.1964b;Frederiksenetal.1965)。蟲草素分子式為C10H13N5O3,其結構式如圖1,分子量為251D,堿性,針狀或片狀結晶。蟲草素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調節(jié)、清除自由基等多種藥理作用(王成明等2009),以蟲草素為主要成分的新藥已在臨床上試用于白血病的治療(Kodamaetal.2000;蔡友華和劉學銘2007),有著良好的臨床應用前景,但大量提取分離其純品非常不易,化學合成也存在一定的弊端,因此國際市場上蟲草素的價格非常昂貴(Nietal.2009),蟲草素的研究正成為藥物化學中一個極其活躍的領域。半個多世紀以來,人們對蟲草素從菌株來源、產量提高、人工合成修飾、藥理活性、作用機制及產品開發(fā)等多方面進行了研究。本文從生物學的角度,對蟲草素的研究現(xiàn)狀進行綜述,分析了其專利現(xiàn)狀,并對其進一步研究提出了看法,以期為蟲草素的進一步研究和開發(fā)利用提供依據(jù)。1天然菌株中的菌株組成及含量目前已報道的蟲草素產生菌主要是蟲草屬的一些種類及從其上分離得到的菌株。除了蛹蟲草子實體及其無性型蛹草擬青霉Paecilomycesmilitaris發(fā)酵菌絲體(雷幫星等2008)外,還有泰山蟲草Cordycepstaishanensis(安秀榮等2007),九州蟲草Cordycepskyushuensis(凌建亞等2002),蟬花Cordycepscicadae(溫魯?shù)?006)及其無性型蟬擬青霉Paecilomycescicadae(李瑞雪等2007),香棒蟲草Cordycepsbarnessii(常泓和張鵬2003),蟲草頭孢菌Cephalosporiumsinensis(李鑫等2003),古尼蟲草Cordycepsgunnii(陳作紅等2003),新疆蟲草Ophiocordycepsgracilis(索菲婭等2008),蝙蝠蛾被孢霉Mortierellahepiali(陳慶濤等1986),擬黑蟲草Ophiocordycepsnigrella(陳自宏等2010),蝙蝠蛾柱霉Scytalidiumhepiali(李兆蘭和孫云漢1988),克列特尼棒束孢霉Isariacretacea(褚西寧等1991)等,用豆天蛾Clanisbilineata的幼蟲為寄主接種蛹蟲草菌得到的豆蟲草中也檢測到了蟲草素,但是含量低于蠶蛹蟲草(華春和溫魯2005)。關于天然冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis及其發(fā)酵菌絲體中蟲草素的存在與否一直存在爭議,本研究組在分析了不同產區(qū)的冬蟲夏草子實體及不同地理來源的冬蟲夏草菌株發(fā)酵菌絲體中蟲草素的含量后,發(fā)現(xiàn)天然冬蟲夏草子實體中基本不含蟲草素,但是發(fā)酵菌絲體中有極其低含量的蟲草素(Dong&Yao2010)。此外,Kaczkaetal.(1964a)從無冠構巢曲霉Aspergillusnidulans中分離出蟲草素后沒有進一步的相關報道,直到張紅霞等(2006)報道了無冠構巢曲霉發(fā)酵菌絲體的蟲草素產量高于蛹蟲草,可以作為蟲草素新的生物來源。2各蟲素的生產周期盡管有上述種類的菌株可以合成蟲草素,蟲草素的生物合成研究卻主要集中于蛹蟲草。蟲草素主要從蛹蟲草子實體中提取,但其子實體生產周期長,導致蟲草素生產成本高,制約了蟲草素進一步的研究和開發(fā)利用。目前蛹蟲草已實現(xiàn)了大規(guī)模發(fā)酵,在提高液體發(fā)酵蟲草素的單位產量方面,國內外學者從菌株誘變、篩選、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件優(yōu)化、激發(fā)子等方面開展了很多工作,取得了一些進展。2.1采用紫外誘變的方法獲得煙草素產量就菌株而言,自然界原始菌株的蟲草素產量往往不高,然而高產菌株的誘變和篩選報道并不多見。Dasetal.(2008)用質子束誘變(protonbeamirradiation)的方法篩選出了蟲草素的高產菌株,比出發(fā)菌株的蟲草素含量高出72%;李文等(2009)選擇合適劑量的低能離子束注入蛹蟲草,獲得菌株的蟲草素產量比出發(fā)菌株提高30%;周禮紅等(2009)通過對蛹蟲草原生質體進行紫外誘變處理,篩選出優(yōu)良菌株,經固體發(fā)酵后,蟲草素含量為出發(fā)菌株的2倍,連續(xù)15代傳代培養(yǎng),蟲草素的含量依然保持穩(wěn)定。航天誘變技術也用在了蛹蟲草的育種研究之中。2005年8月29日中國發(fā)射的第22顆返回式科學與技術試驗衛(wèi)星中有3支蛹蟲草試管菌種,研究表明航天搭載蛹蟲草的蟲草素含量較原始菌株提高2.5倍(溫魯?shù)?008)。2.2碳氮素part和硫酸亞鐵、氯化鈣關于蟲草素培養(yǎng)基的優(yōu)化研究較多,基本上所有的實驗均考慮到了碳源、氮源以及碳氮比的影響,但是不同的實驗可能因為菌株和其他實驗條件的不同,優(yōu)化的碳源、氮源不盡相同,但是碳源采用葡萄糖的較多(Maoetal.2005;Masudaetal.2006)。氮源以酵母提取物(Shihetal.2007)或者酵母提取物與蛋白胨混合物(Masudaetal.2006;Guetal.2007)為主,較低的碳氮比有利于提高蛹蟲草的蟲草素產量(Maoetal.2005;Shihetal.2007)。Xieetal.(2009)以農副產品糙米糊(brownricepaste)、麥芽汁和大豆汁作為培養(yǎng)基也得到了較高產量的蟲草素。無機鹽離子影響蟲草素的產量。在培養(yǎng)基中加入適量的硒可促進蛹蟲草蟲草素的合成(王志高等2007;賁松彬等2009);硫酸亞鐵和氯化鈣是影響蟲草素產量的關鍵因子(毛先兵和馬開森2004),這些離子可能作為酶的輔因子發(fā)揮作用。此外,NH4+有類似的作用,它對蟲草素產量的提高可能不僅在于提供了氮源,而且與能量代謝有關,因為NH4+能激活H+-ATPase(Mao&Zhong2006)。無機鹽離子的添加雖然能增加蟲草素的產量,但會給后續(xù)的分離純化鑒定等過程帶來不利影響。2.3基于溶氧的合成雜草素目前關于蛹蟲草的液體培養(yǎng)模式可分為表面培養(yǎng)(Surfaceculture)和深層發(fā)酵(Submergedfermentation)。Shihetal.(2007)比較了靜止、搖床培養(yǎng)的蟲草素產量和產率,發(fā)現(xiàn)靜止培養(yǎng)的蟲草素產量高于搖床培養(yǎng),但是其達到最大產量需要更長的時間,所以產率低于搖床培養(yǎng),于是提出了兩段培養(yǎng)(先搖床培養(yǎng)后靜止培養(yǎng))的模式,能顯著提高蟲草素的產量和產率。靜止培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)的差別反應出溶氧水平對蛹蟲草蟲草素合成的調控。Mao&Zhong(2004)通過對溶氧水平的研究,提出了發(fā)酵罐溶氧調控策略:培養(yǎng)的前期溶氧控制在60%,當蟲草素產率開始下降時將溶氧降至30%,這樣蟲草素的產量和產率可以分別增加15%和30%。另外補料分批培養(yǎng)策略也在蛹蟲草蟲草素的優(yōu)化中得到了應用(毛先兵和涂永勤2005)。其他對蛹蟲草蟲草素培養(yǎng)條件的研究認為其最適pH為6左右(Shihetal.2007);最適溫度為20-25℃,采用遮光培養(yǎng)能促進蟲草素的合成(溫魯?shù)?005)。除蛹蟲草外,對蟬擬青霉(李瑞雪等2007)、擬黑蟲草菌(陳自宏等2010)等菌株的蟲草素產生條件也進行了優(yōu)化,但是都低于蛹蟲草蟲草素的產率。2.4曲霉多糖對菌株中雜草素激發(fā)的影響前體物質及激活子對蟲草素合成有促進作用,貴州大學生命科學學院真菌資源研究所在此方面開展了大量的工作并顯著提高了蟲草素的產量。腺嘌呤核苷和腺嘌呤是蟲草素合成的前體物質,培養(yǎng)基中添加適量的腺苷和腺嘌呤,蟲草素的產量顯著提高,其中添加腺嘌呤的效果好于腺嘌呤核苷(李祝等2008;文庭池等2010)。甘氨酸、L-谷氨酰胺也能刺激蛹蟲草液體發(fā)酵胞外蟲草菌素產量的提高,而且和前體物質腺苷、腺嘌呤有協(xié)同作用(文庭池等2010)。步嵐等(2002)將曲霉Aspergillumsp.、青霉Penicilliumsp.、根霉Rhizopussp.、疫霉Phytophthorasp.、灰霉Cinereasp.等配制的真菌激發(fā)子培養(yǎng)液加入到蛹擬青霉的培養(yǎng)物中,發(fā)現(xiàn)疫霉、灰霉做激發(fā)子菌株可提高蟲草素的含量,但是發(fā)揮作用的成分不明;分別提取真菌多糖作為激發(fā)子,發(fā)現(xiàn)不同來源的多糖激發(fā)作用并不完全相同,疫霉YL和曲霉P6-1兩株真菌的菌絲體多糖可以提高蟲草素的產量和生物量。在發(fā)酵起始階段加入疫霉多糖,72h后再加入曲霉多糖,蟲草素的含量可達到對照的5.7倍(李祝等2006)。有意思的是,蛹蟲草與紅曲霉菌株MonascusrubberMT305共培養(yǎng)也能提高蟲草素含量(周禮紅和蔣春玲2008)。炭角菌屬銀杏內生真菌Xylariasp.YX-28菌株提取液制備的激發(fā)子和非生物型誘導子乙酸鈉、硫酸銨也能促進蟲草素的產生(劉小莉等2009)。在培養(yǎng)營養(yǎng)液中加入生長調節(jié)因子2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、檸檬酸三胺、秋水仙素和鏈霉素對提高蛹蟲草子實體產量及蟲草素含量有促進作用(肖正華等2010)。激素類物質如β-蛻皮激素(施明珠等2008),保幼激素Ⅲ(施明珠等2009)等也能有效地促進蟲草素的產生。盡管很多前體及營養(yǎng)物質能增加蟲草素的產量,但對它們的作用機制研究得不夠深入。以腺嘌呤為例,它是蟲草素的前體物質,添加后是否是因為細胞攝入量增加,從而提高蟲草素合成原料的含量增加產率還有待研究。3草素的測定和分離處理方法3.1高效液相色譜法蟲草素的紫外、紅外光譜(陳順志等1996)、超導核磁共振法(陳順志等1995)可以用于蟲草素的初步鑒定,而目前蟲草素的分析測定多采用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析法,一般均采用反相色譜法,以十八烷基鍵合硅膠為固定相,流動相有很多種,如甲醇-水(85:15)、甲醇-pH6的磷酸鹽緩沖液(17:3)或乙腈-水(90:10)等等。薄層色譜掃描法(thin-layerchromatographyscanning,TLCS)具有展開時間短、顯色方便、價格較便宜的特點,但此法測定蟲草素含量的準確度和精密度均略低于HPLC(翁梁和溫魯2008)。國內有人綜合HPLC與TLCS的優(yōu)點,將兩者結合起來,對蟲草素含量進行定性定量測定(吳洪臻等2000)。高效毛細管電泳技術(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)是近年來分析化學中發(fā)展迅速的領域之一,它兼有高壓電泳的高速、高分辨率及高效液相色譜的高效等優(yōu)點,同時又因其樣品預處理簡單,用量少,自動化程度高等優(yōu)點,也用于蟲草素的測定及鑒別(凌建亞等2002;徐健君等2005)。關于蟲草素測定的具體方法劉東澤等(2004)進行了詳細的總結。3.2不同提取方法的提取效果研究表明蛹蟲草合成的蟲草素部分分泌到了培養(yǎng)基中(Masudaetal.2006,2007;文庭池等2010)。因此蟲草素的提取原料除了子實體、菌絲體外,還有固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基殘渣(韋會平等2009;吳勇等2010)、菌皮(鐘運俊等2008)等。根據(jù)蟲草素溶于水、熱乙醇和甲醇的性質,蟲草素的提取一般采用水、50%乙醇、乙醇和甲醇等溶劑。除直接進行提取外,還可先用乙醚脫脂,再進行提取。提取方法主要有浸提法、回流法、滲漉法、超聲法、索氏提取法和超臨界萃取法等,不同的提取原料適用的方法不同。多個研究表明對于蛹蟲草菌絲體而言,浸提法耗時過長,且提取效果一般,不利于下一步實驗的進行;超聲波提取法快捷、簡便且準確度高,受實驗環(huán)境、儀器人員條件等因素的限制少,具有較高的提取效率(凌建亞等2002)。黃子琪等(2009)報道微波法要好于超聲波提取法,也有報道用微波-超聲波協(xié)同提取(王陶等2010)。超臨界CO2萃取法雖然有較好的效果(陳順志等2002;Lingetal.2009),但是由于成本過高,需要特殊設備,難以進行大規(guī)模應用。對于固體培養(yǎng)基殘渣,吳勇等(2010)采用6種不同的提取方法對其中的蟲草素進行提取,提取物的收率順序為:滲漉法>微波法>水熱回流法>醇熱回流法>超聲波水法>超聲波醇法。滲漉法提取蛹蟲草固體培養(yǎng)基中的蟲草素具有提取率相對較高、操作簡單、可行性強、不需要較昂貴的儀器,缺點是時間較長;微波法提取則具有提取時間較短的優(yōu)點?，F(xiàn)代提取技術連續(xù)逆流提取也用于了培養(yǎng)基殘渣中蟲草素的提取(韋會平等2009)?？傊?蟲草素的提取方法針對不同的原材料采用不同的方法,而每種方法都要經過優(yōu)化得到其最佳工藝,不僅要考慮提取的速率、得率,更重要的是要與后續(xù)的純化方法結合起來,以達到滿意的產品純度和低成本要求。3.3采用吸附、分離的方法生物降解雜草素Cunninghametal.(1951)將蛹蟲草菌培養(yǎng)液經過濾后用活性炭吸附,再經過洗脫液洗脫和濃縮,得到蟲草素晶體,這種方法工藝簡單、成本低,但吸附選擇性差、得率低。目前蟲草素分離純化比較常用的方法是離子樹脂吸附法、硅膠柱層析法、超臨界萃取技術等。離子樹脂吸附法的關鍵在于篩選吸附能力較強及吸附量較多的樹脂和優(yōu)化洗脫方法。目前多用732-NH4+型陽離子交換樹脂,但所提取的蟲草素較少,提取率較低(車振明2004;毛先兵等2008)。陳星(2001)采用反吸附不交換的方法,即首先調pH使蟲草素不被離子樹脂吸附,而無關的離子均被離子樹脂吸附,除去干擾成分;然后調pH使蟲草素被吸附在柱體上,再經洗脫后獲得蟲草菌素結晶,可得純度在98%以上的蟲草素晶體,并申請了專利。近年來,大孔吸附樹脂也用在了蟲草素的分離純化中。呂子明等(2008)用大孔吸附樹脂和硅膠色譜柱成功分離鑒定出9種化學成分,包括蟲草素;Nietal.(2009)采用DM130大孔吸附樹脂,然后用聚酰胺柱層析得到純度98%以上的蟲草素晶體。劉紅錦等(2010)考查了7種大孔吸附樹脂對蟲草素的吸附純化效果,篩選出適宜的樹脂AB-8。此外,硅膠柱層析可以分離與富集蟲草素(陳偉等2006)。陳順志等(2002)采用超臨界萃取得到蟲草素晶體,純度為50.0%-99.9%,該技術無污染,易操作,不損害活性天然成分的結構,但所得蟲草素的純度依然不夠理想,且成本比較高。4基因水平分析蟲草素生物合成涉及多基因的表達和調控,開展并克隆與蟲草素生物合成相關基因的研究,有助于從分子水平了解蟲草素生物合成的調控機制,為通過基因操作提高蟲草素的產量奠定基礎。目前,該方面的研究還鮮有報道。莫紅麗等(2010)使用誘變劑對蛹蟲草菌株進行誘變,篩選蟲草素高表達的菌株,在確定該突變穩(wěn)定可遺傳的基礎上,采用抑制消減雜交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)技術,對蟲草素表達產生的差異進行基因水平上的分析,以突變型(高表達蟲草素的菌株)作為檢測子,以野生型(未作誘變處理的出發(fā)菌株)作為驅動子,經過消減雜交后得到一組正調控基因片段的克隆,并對該組克隆進行了序列測定,克隆出7個蟲草素生物合成相關的序列,分別命名為chcs1、chcs2、chcs3、chcs4、chcs5、chcs6、chcs7,這些序列均為蛹蟲草中首次報道,但是它們的具體功能如何,還有待進一步研究。通過構建含有上述基因的高效植物表達轉化載體,增加菌體內生物合成基因拷貝量,以提高蟲草菌表達蟲草素的含量,并申請了專利(葉小舟等2009)。目前為止在GenBank上還檢索不到有關蟲草素合成的相關基因。5雜草素衍生物的專利在中華人民共和國國家知識產權局的專利數(shù)據(jù)庫中,以蟲草素為關鍵詞檢索到74個專利,包括73個發(fā)明專利和1個實用新型專利(截止2010年11月18日)。專利內容涵蓋了蟲草素的提取純化方法、蟲草素產量提高的方法、含有蟲草素的產品開發(fā)、蟲草素合成基因、蟲草素衍生物等幾個方面(圖2),其中關于蟲草素的產品開發(fā)專利最多,占1/3,涉及蟲草素合成基因的專利2個,蟲草素衍生物的專利1個。在產品開發(fā)方面,均是以蛹蟲草子實體或菌絲體為原料的開發(fā),包括了含有蟲草素的茶、酒、膨化食品、中藥、口香糖、蟲草蛋、調味品等,以純蟲草素為原料的產品開發(fā)還沒有。另外我們將涉及冬蟲夏草中蟲草素的專利歸為了一類,共計10個,占13.69%,因為眾多研究已證實冬蟲夏草中蟲草素不存在或極其微量,顯然這類專利值得我們慎重對待。以cordycepin為關鍵詞在歐洲專利局的數(shù)據(jù)庫中共檢索到128個專利(截止2010年11月18日),主要來自中國、韓國、日本和美國4個國家,其中中國人申請的專利83個,占64.84%,內容分布和國內專利基本一致,含有蟲草素的產品開發(fā)較多,其次是蛹蟲草的培養(yǎng)方法、提高蟲草素產量的方法和蟲草素提取純化方法。日本和韓國人申請的專利分別為21和20個。專利內容體現(xiàn)在蟲草素產量的提高、衍生物和產品開發(fā)方面。美國人申請的專利4個,均集中在蟲草素衍生物的研究方面。國際專利的分布和人們對蟲草的認識相關,冬蟲夏草在中國歷史悠久,可以說是家喻戶曉,以冬蟲夏草、蛹蟲草為原料的保健品、藥材在中國及東南亞有著良好的聲譽,因此相關研究和產品開發(fā)也較多。6目前植物素研究6.1雜草素的商業(yè)價值很蟲草素具有抗菌、消炎、抗腫瘤、調節(jié)人體內分泌和增強人體免疫功能等顯著作用,因此無論是在醫(yī)藥還是保健食品方面,蟲草素都擁有巨大的開發(fā)價值和廣闊的市場前景。蟲草素療效顯著但大量提取分離得到純品存在困難,導致國際市場上蟲草菌素的價格非常昂貴,目前sigma公司從蛹蟲草提取得到的蟲草素售價是0.1克6853.86元(SigmaC3394),隨著研究的深入,蟲草素的商業(yè)價值更是不可估量。我國東北、江蘇、浙江等有關科研院所也從蛹蟲草中提取到了蟲草素樣品,但至今全球仍未見有任何國內外科研院所和工廠企業(yè)能夠真正實現(xiàn)工廠化批量提取生產的報道,也就是說目前全世界還未能實現(xiàn)蟲草素生物合成的產業(yè)化。目前提取蟲草素的主要原料為蛹蟲草,不論是人工栽培子實體還是液體發(fā)酵菌絲體都已經實現(xiàn)了產業(yè)化,蟲草素的藥理藥效和作用機制越來越明了,其開發(fā)利用具有良好的市場前景。6.2菌株誘變及微生物來源檢測在目前通過基因工程生產蟲草素還不現(xiàn)實的情況下,從種質資源入手應該是一個很好的思路。一方面,通過各種誘變手段對蛹蟲草菌株進行誘變,篩選蟲草素產量高的菌株,克服菌株退化;另一方面,研究探索蟲草素新的微生物來源。雖然有報道無冠構巢曲霉及一些其他種的蟲生真菌也能產生蟲草素,但對于其菌株誘變篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化等進一步研究還不夠。尋找生長速度較快且產蟲草素能力強的其他菌株,將可能成為蟲草素的另一個重要生物源。6.3采用高效的提取工藝目前國內外對蟲草素分離純化工藝進行了積極的研究,并取得了一定的進展。但是,現(xiàn)有的方法都不同程度地存在著提取率低