RocheLightCycler480中文操作說明

LightCycler480中文操作說明PAGEPAGE2LightCycler?480中文操作說明羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司/應(yīng)用科學(xué)部門February2008目錄一.啟動機(jī)器與軟件3二.軟件設(shè)定開啟新實(shí)驗(yàn)5三.樣品編輯9四.結(jié)果分析12五.報(bào)告18六.數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計(jì)算機(jī)(數(shù)據(jù)輸出與輸入)19七.使用者管理19

一．啟動機(jī)器與軟件啟動機(jī)器機(jī)器主開關(guān)位于機(jī)器右后方。機(jī)器正面兩個警示燈代表機(jī)器狀態(tài)。待警示燈(右)由閃爍橘色燈轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定橘色燈，警示燈(左)由橘色轉(zhuǎn)變成綠色(約三分半鐘)，表示機(jī)器已經(jīng)啟動完成。左警示燈右警示燈機(jī)器狀態(tài)橘*閃爍*橘*閃爍*正在初始化綠橘機(jī)器啟動完成96/384孔盤還未放入綠橘*閃爍*96/384孔盤正在放入中綠綠機(jī)器啟動完成96/384孔盤已經(jīng)放入綠*閃爍*綠*閃爍*實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中按壓機(jī)器正面上唯一的按鈕，放入已經(jīng)封膜完成之96或384孔盤。放置完成后，左右兩警示燈都呈現(xiàn)綠色。啟動軟件開啟計(jì)算機(jī)，并以正確的使用者名稱與密碼登入Windows。Username:OPERATORPassword:LC480開啟LightCycler480軟件，并輸入正確的使用者與密碼。

二．軟件設(shè)定--開啟新實(shí)驗(yàn)設(shè)定新實(shí)驗(yàn)軟件開啟后，會進(jìn)入主畫面。點(diǎn)選“NewExperiment”。出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)定窗口。任何時(shí)候需要回主畫面的話，點(diǎn)選畫面右邊的按鈕。設(shè)定實(shí)驗(yàn)若要套用設(shè)定好的實(shí)驗(yàn)步驟(Template)，請?zhí)?.。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定畫面上方，先選擇適當(dāng)?shù)腄etectionFormat。選項(xiàng)包含:另外可再點(diǎn)選“Customize”勾選所需的濾片組合。輸入反應(yīng)體積:96wellplate范圍為10-100ul，而384wellplate范圍為5-20ul。設(shè)定實(shí)驗(yàn)步驟(Program)設(shè)定program，包含有Pre-incubation,Amplification(PCR),Meltingcurve(optional)與Cooling。利用『+』與『－』增加或刪除步驟。設(shè)定循環(huán)數(shù)目(Cycle)與分析模式。通常Amplification(PCR)program設(shè)定成『Quantification』，而MeltingCurveprogram設(shè)定成『MeltingCurve』。設(shè)定詳細(xì)溫度變化(依照不同實(shí)驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)而有所不同)點(diǎn)選各個program即可設(shè)定詳細(xì)溫度變化步驟，請根據(jù)產(chǎn)品說明書來設(shè)定，利用『+』與『－』增加或刪除步驟。需要設(shè)定的參數(shù)包含Target(℃)目標(biāo)溫度，AcquisitionMode(熒光偵測模式)，Hold(hh:mm:ss)停留時(shí)間。RampRate(℃/s)為升降溫速度，范圍如下：RampRate(℃/s)HeatingupCoolingdown96-wellBlock1.0–4.4℃/s1.0–2.2℃/s384-wellBlock1.0–4.8℃/s1.0–2.5℃/s若設(shè)定溫度低于50℃，請把RampRate調(diào)整成1.5℃/s(96well)或2.0℃/s(384well)。將實(shí)驗(yàn)步驟儲存成『Template』以便下次進(jìn)行套用。點(diǎn)選左下角“SaveAsTemplate”即可把此步驟儲存起來。若要進(jìn)行套用時(shí)，請直接點(diǎn)選窗口左下角“ApplyTemplate”，選擇欲套用之實(shí)驗(yàn)步驟即可。設(shè)定完成后點(diǎn)選“StartRun”開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。跳出檔案儲存窗口，請輸入欲儲存之文件名稱。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中會進(jìn)入另一個Data窗口，窗口下方按鍵功能如下：EndProgram:結(jié)束此Program,進(jìn)入下一個Program。+10Cycles:實(shí)時(shí)增加循環(huán)數(shù)目。AbortRun:馬上結(jié)束此實(shí)驗(yàn)，請注意，若按此鍵，則此次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將不儲存。

三．樣品編輯將樣品分群點(diǎn)選窗口左邊的“SubsetEditor”。點(diǎn)選“New”新增新的群組，并將其命名。利用鼠標(biāo)選取此群組之樣品位置，點(diǎn)選窗口右下角“Apply”，此時(shí)被選取的樣品位置會呈現(xiàn)實(shí)心的藍(lán)色，如下圖。以此方式依序?qū)⑺袠悠啡航M編輯完畢。樣品必須分群才能夠獨(dú)立分析，但是樣品是否分群并不影響樣品的Cp值。

編輯樣品名稱點(diǎn)選窗口左邊的“SampleEditor”。輸入每個位置之樣品名稱(Name)與重復(fù)(Repl.Of)。若要更快速輸入，可直接在左邊的圖上點(diǎn)選欲編輯之樣品：若A1,A2與A3為三重復(fù)，在A2與A3Repl.Of字段上都填上A1即為三重復(fù)。在編輯過程中，可利用『Ctrl』+『C』復(fù)制文字，『Ctrl』+『V』貼上文字。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析模式，編輯AbsQuant(絕對定量)，RelQuant(相對定量)，或Genotyping分頁，設(shè)定SampleType。絕對定量(AbsQuant)：『Unknown』:未知濃度樣品『Standard』:已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品

相對定量(RelQuant)：『Target』:目標(biāo)基因『Reference』:參考基因『Calibrator』:Control樣品『Standard』:已知濃度的樣品『Unknown』:未知濃度樣品其它分析模式之分頁在此不贅述，請自行參考LightCycler480InstrumentOperator’sManual。若設(shè)定成『Standard』之樣品請輸入濃度。若想要將此樣品編輯儲存成Template，可點(diǎn)選窗口左下角“SaveAsTemplate”即可，下次實(shí)驗(yàn)時(shí)可點(diǎn)選“ApplyTemplate”進(jìn)行套用。

四．結(jié)果分析點(diǎn)選左邊的“Analysis”，選取分析模式，并選擇所需分析之群組，如下圖：3.2.1.3.2.1.分析模式說明AbsQuant/2ndDerivativeMax絕對定量(自動法)AbsQuant/FitPoints絕對定量(手動法)ColorCompensation色差校正(多色實(shí)驗(yàn)校正用)GeneScanning基因掃描(適用于HighResolutionMeltingCurve,HRM分析)Genotyping基因分型(適用于HybProbe之基因分型實(shí)驗(yàn))RelativeQuantification相對定量TmCallingTm分析絕對定量(AbsoluteQuantification)點(diǎn)選下方的“Calculate”即可得到樣品之Cp與標(biāo)準(zhǔn)曲線。各個樣品之Cp各個樣品之Cp值與濃度重複樣品平均後之重複樣品平均後之Cp值與濃度,並自動計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值之?dāng)?shù)據(jù)輸出:在數(shù)值分析表上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選“Export”即可輸出成.txt檔案格式。可直接以MicrosoftExcel軟件開啟。圖形輸出:在圖形上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選“Export”即可輸出成各種圖形檔案格式。標(biāo)準(zhǔn)曲線儲存:點(diǎn)選窗口下方StdCurve之“Saveasexternal”，輸入適合檔名后即可儲存在數(shù)據(jù)庫中。相對定量(RelativeQuantification)在選擇相對定量分析后，出現(xiàn)下面窗口：ReferenceSampleLocation:若Reference(Housekeepinggene)之樣品在同一盤上請選擇“In-Run”，否則請選擇“External”可輸入另一次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)一起分析。建議將AutoPair打勾讓計(jì)算機(jī)自動將樣品配對。進(jìn)入『Target』與『Reference』分頁，右下角顯示“Eff=2”表示將目標(biāo)基因與參考基因的PCR效率以2.0來計(jì)算。若需要校正目標(biāo)基因與參考基因之PCR效率，則需要輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線。在『Target』與『Reference』分頁之右下角，輸入(import)標(biāo)準(zhǔn)曲線。Useinrun：輸入(import)同一盤上之標(biāo)準(zhǔn)曲線。Useexternal：輸入(import)之前已儲存于數(shù)據(jù)庫中之標(biāo)準(zhǔn)曲線。點(diǎn)選『Pairing』分頁，檢查計(jì)算機(jī)自動配對結(jié)果是否正確。其中，紅色表示Unknown樣品，綠色表示Calibrator樣品。若欲外加配對，則可直接以鼠標(biāo)點(diǎn)選樣品后按“Add”即可增加配對。點(diǎn)選『Results』分頁，點(diǎn)選“Calculate”即可得到計(jì)算結(jié)果。數(shù)值和圖形輸出與絕對定量相同。(請參考絕對定量)基因分型(Genotyping)進(jìn)入基因分型的窗口中。窗口右下角可設(shè)定分類方式AutoGroup：自動分組In-run：標(biāo)準(zhǔn)品包含在本次實(shí)驗(yàn)中External：標(biāo)準(zhǔn)品在之前已儲存之實(shí)驗(yàn)中點(diǎn)選“Calculate”即可得到分型結(jié)果。

Tm分析(TmCalling)進(jìn)入Tm分析窗口確認(rèn)波峰數(shù)目選擇檢測模式點(diǎn)選“Calculate＂即可得到每個樣品之Tm值。

五．報(bào)告(Report)將分析后結(jié)果儲存后即可點(diǎn)選報(bào)告鍵。數(shù)據(jù)儲存報(bào)告勾選想要呈現(xiàn)的報(bào)告內(nèi)容。點(diǎn)選“Generate”即可產(chǎn)生報(bào)告。點(diǎn)選“PDF”即可將此報(bào)告儲存成.pdf檔案格式。

六．?dāng)?shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計(jì)算機(jī)(數(shù)據(jù)輸出與輸入)數(shù)據(jù)輸出點(diǎn)選(navigato