細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告第2頁第3頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告第1頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告小鼠脾細(xì)胞原代培養(yǎng)姓名：杜旭學(xué)號：201100230155系年級：2011級臨七一班同組者：趙偉日期：2012/4/25【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹竣睂W(xué)習(xí)并掌握動物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。⒉了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法及操作過程。⒊學(xué)習(xí)細(xì)胞計(jì)數(shù)及營養(yǎng)液的配制?！緦?shí)驗(yàn)原理】⒈細(xì)胞原代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個游離細(xì)胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必須的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。⒉細(xì)胞死活鑒定死活細(xì)胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細(xì)胞死活鑒定方法，簡便，易于操作。不同的死活細(xì)胞鑒定方法有各自不同具體的反應(yīng)機(jī)理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異。染色法分化學(xué)染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機(jī)理的不同，染料或使死細(xì)胞著色，或使活細(xì)胞著色?！袼阑罴?xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異主要包括：☆死活細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜，對細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過；而細(xì)胞死亡之后，細(xì)胞膜受損，通透性增加。常用的以臺盼藍(lán)鑒別細(xì)胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺盼藍(lán)，又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細(xì)胞膜。所以經(jīng)臺盼藍(lán)染色后只能使死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。甲基藍(lán)有類似的染色機(jī)理。植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活。☆死活細(xì)胞在代謝上的差異：是采用美藍(lán)染料鑒定酵母細(xì)胞死活的依據(jù)。美藍(lán)是一種無毒染料，氧化型為藍(lán)色，還原型為無色。由于活細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化性變?yōu)闊o色的還原型，因此美藍(lán)染色后活的酵母細(xì)胞無色；而死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍(lán)處于氧化態(tài)，從而被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。除此之外，還有一些細(xì)胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細(xì)胞液泡著紅色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不被著色；死細(xì)胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個細(xì)胞中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。有時(shí)侯為了增加染色效果可以將兩種染料結(jié)合使用，如甲基藍(lán)-中性紅混合染色法。【實(shí)驗(yàn)用品】⒈材料小白鼠⒉試劑臺盼藍(lán)、伊紅、PBS緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液（含生長因子）⒊器材剪子、棉球、75%酒精、移液槍、無菌操作臺、正置光學(xué)顯微鏡、倒置光學(xué)顯微鏡、解剖盤、滴管、離心管、離心機(jī)、注射器、Eppendorf管、培養(yǎng)皿、酒精燈、塑料培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板【實(shí)驗(yàn)步驟】⒈取材取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。⒉分離脾細(xì)胞用滴管向培養(yǎng)皿中注入30滴PBS緩沖液，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時(shí)沿長軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用“L”型針頭輕輕刮出脾細(xì)胞。在均勻吹勻脾臟細(xì)胞。吸取上述分離的單個脾細(xì)胞懸液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。⒊培養(yǎng)脾細(xì)胞取塑料培養(yǎng)皿一套，用移液槍吸取培養(yǎng)液2mL加入塑料皿中，并將皿標(biāo)記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞，吸取200ul脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⒋配制染液用生理鹽水配成5%臺盼藍(lán)染液，備用。⒌染色取0.5mL細(xì)胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液?；旌?。2-5min后將細(xì)胞放在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上觀察死活情況，注意不要有氣泡產(chǎn)生，放大倍數(shù)為10x10。染色后活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞顯示藍(lán)色。注意染色時(shí)間不能超過15min，否則染液將細(xì)胞毒殺。⒍計(jì)數(shù)在10x10倍的顯微鏡下觀察，計(jì)算血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的4個4小方格的細(xì)胞數(shù)量。包括細(xì)胞總數(shù)與死細(xì)胞數(shù)量。壓線者計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。⒎計(jì)算細(xì)胞活力根據(jù)公式：細(xì)胞活力=(總細(xì)胞數(shù)-死細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】臺盼藍(lán)染色后的細(xì)胞（10x10）伊紅染色后的細(xì)胞（10x10）總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)表（10×10）項(xiàng)目總細(xì)胞數(shù)﹙個/ml﹚活細(xì)胞數(shù)﹙個/ml﹚細(xì)胞活力自己培養(yǎng)細(xì)胞1.4×1063.0×10521.4%老師培養(yǎng)細(xì)胞7.5×1055.5×10573.3%【分析與討論】⒈結(jié)果分析本次實(shí)驗(yàn)中我們小組自己培養(yǎng)細(xì)胞所測細(xì)胞活力為21.4%，并不算高，分析得應(yīng)有以下原因可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（包括誤差）：⑴若在無菌操作的過程中操作不規(guī)范，導(dǎo)致染菌，會極大的影響觀察，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。⑵若在離心分離呈單細(xì)胞的過程中離心機(jī)轉(zhuǎn)速過快或時(shí)間過長很可能會導(dǎo)致細(xì)胞破裂，導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞大量死亡。⑶染色時(shí)間過長，或觀察時(shí)間過長都會導(dǎo)致染色試劑將細(xì)胞殺死，使細(xì)胞活力驟降，這是導(dǎo)致細(xì)胞活力比較低的重要原因。⑷實(shí)驗(yàn)中的一些操作不正確或不規(guī)范的情況、計(jì)算帶來的誤差等也會直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。⒉注意事項(xiàng)⑴嚴(yán)格進(jìn)行動物消毒，需用75%酒精消毒。⑵嚴(yán)格進(jìn)行無