植 物 組 培實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：煙草植物組織培養(yǎng)班級(jí)：姓名：學(xué)號(hào)：煙草植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)技術(shù)的基本原理；2、掌握培養(yǎng)基配制方法、步驟及培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，外植體滅菌、接種、培養(yǎng)觀察等技術(shù)環(huán)節(jié)；3、了解外植體脫分化及再生過程。實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞全能性（totipotency）指植物的每個(gè)細(xì)胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。在適宜條件下，任何一個(gè)細(xì)胞都可以發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體。植物細(xì)胞全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。2、植物細(xì)胞表現(xiàn)出全能性的條件離體狀態(tài)；有一定的營養(yǎng)物質(zhì)，激素和其他外界條件（如無菌、溫度、pH）；選擇性能優(yōu)良、細(xì)胞全能性表達(dá)充分的基因型；3、組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)(Tissueculture)是指在無菌條件下，分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)離體植物組織(器官或細(xì)胞)的技術(shù)。廣義的組織培養(yǎng)：包括器官培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，胚胎培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)，原生質(zhì)培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)等；狹義的組織培養(yǎng)是指植物離體快繁技術(shù)卸微型繁殖(Mieropropagation)或試管繁殖技術(shù)。4、常用的培養(yǎng)基植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。凝固劑常用瓊脂粉，它最主要的作用是使液體培養(yǎng)基凝固，瓊脂本身并不提供任何營養(yǎng)，它只是一種高分予的碳水化合物，從海藻中提取出來，僅溶解于熱水，成為溶膠，冷卻后(40℃以下)即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量一般在4—10克／升之間。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式等有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH值等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解而喪失凝固能力，存放時(shí)間過久，瓊脂變褐，也會(huì)逐漸失去凝固能力。5、植物激素（1）培養(yǎng)基中添加的激素是植物激素，是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠等許許多多的生理生化活動(dòng)。在培養(yǎng)基的各種成分中，植物激素所產(chǎn)生的影響最大。通過對培養(yǎng)物營養(yǎng)需求的研究，可擬定出目標(biāo)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基配方，對植物生理過程的探索，可了解并獲得最有成效的植物激素，這兩個(gè)方面可以認(rèn)為是植物組織培養(yǎng)不可或缺的二個(gè)層面?；九囵B(yǎng)基保證培養(yǎng)物的生成與最低的生理活動(dòng)，只有配合使用適當(dāng)?shù)闹参锛に夭拍苷T導(dǎo)細(xì)胞的分裂，愈傷組織的生長以及根、芽的分化或胚壯體的發(fā)育等。對于培養(yǎng)大多數(shù)植物材料來說，選擇任何一種常用的基本培養(yǎng)基都能得類似的效果，只有植物激素的種類和濃度搭配合理，才能生長出健壯的植株，這一點(diǎn)要根據(jù)瓶中培養(yǎng)物的表現(xiàn)來確定。（2）常用于植物組織培養(yǎng)的植物激素種類主要有生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素。生長素的生理作用主要是促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)受傷的組織表面一至數(shù)層細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，形成愈傷組織，促進(jìn)生根。細(xì)胞分裂素的生理作用主要為促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，可使莖增粗，誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長，抑制、延緩衰老，有保鮮的效果。赤霉素(GA)的生理作用主要是誘導(dǎo)芽的細(xì)胞伸長。對矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效：IAA／GA比值高有利于木質(zhì)部分化，比值低利于韌皮部分化。實(shí)驗(yàn)材料植物材料：煙草葉片2、實(shí)驗(yàn)藥品：MS培養(yǎng)基（見表.2-1）、蔗糖、瓊脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。3.儀器設(shè)備：高壓滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、天平、PH計(jì)、超經(jīng)工作臺(tái)、酒精燈。4.器械及用具：鑷子、手術(shù)刀、記號(hào)筆等5.玻璃器皿：培養(yǎng)瓶、量筒、容量瓶等。實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基的選擇及母液配制（常用的培養(yǎng)基MS、B5、N6、WPM等）（1）大量元素配成10倍母液，使用時(shí)每1L培養(yǎng)基需要從母液中取100ml。配制母液時(shí)應(yīng)做到分別稱量，充分溶解，在混合次序上應(yīng)最后加入Ca2+，混合時(shí)要邊加邊混合。（2）微量元素配成100倍母液，使用時(shí)每配制1L培養(yǎng)基從母液中取10ml，配制時(shí)應(yīng)注意充分溶解后再依次混合。（3）鐵鹽單獨(dú)配制，與其它元素混合易造成沉淀。一般采用鰲合鐵，即FeSO4與EDTA鈉鹽的混合物，一般擴(kuò)大100倍。EDTA鈉鹽須用溫水溶解，然后與FeSO4液混合，在75~80℃之間讓其鰲合1h。使用鰲合鐵的目的是避免沉淀，并使培養(yǎng)基能緩慢不斷地供應(yīng)Fe2+。有機(jī)物質(zhì)可配成100倍濃縮液，使用時(shí)每1000ml培養(yǎng)基加10ml。培養(yǎng)基的配制取1000ml燒杯，先加入500ml的蒸餾水，然后根據(jù)培養(yǎng)基成分及用量，吸取各種母液加入燒杯，稱取蔗糖（一般用量3%）、瓊脂（一般6-8g/L），按需要的濃度加入植物激素，加水至800ml，加熱使瓊脂融化，定容到1000ml，用1NNaOH或HCl調(diào)PH至5.8。培養(yǎng)基滅菌將配好的培養(yǎng)基迅速分裝至50ml三角瓶中，用牛皮紙或報(bào)紙包扎封口。放入滅菌鍋121℃，滅菌20min。4、外植體取材、消毒及接種自大田或溫室取材時(shí)應(yīng)選擇無病、五蟲、生長健壯的外植體。對于難消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用自來水沖凈，在70%酒精中浸30s，再加入消毒劑。不同的材料消毒的方式和所需時(shí)間不一樣，研究者應(yīng)根據(jù)不同材料確定具體消毒方案。外植體的消毒的一般順序?yàn)椋和庵搀w----自來水多次沖洗----消毒液處理（75%乙醇30s，消毒液xmin）----無菌水沖洗----無菌濾紙吸干----接種。無菌操作操作前把準(zhǔn)備好的接種材料用的培養(yǎng)基、待消毒的材料、無菌水、無菌燒杯及其它必需玻璃器皿、無菌操作工具（如鑷子、解剖刀等，這些工具可用高溫消毒，也可用高壓高溫滅菌，也可隨用隨消毒）、70%酒精等放到超凈工作臺(tái)上，然后打開超凈工作臺(tái)和紫外燈，讓其運(yùn)行20min后再進(jìn)行操作，在超凈工作臺(tái)上打開燒杯和無菌水瓶蓋，將HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的燒杯中，5~10min后取出另一盛有無菌水的燒杯中，無菌水沖洗3~4次，然后將材料取出接種在培養(yǎng)基中，封口，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。6、煙草葉片離體培養(yǎng)及植物再生（1）取煙草幼嫩葉片自來水充分洗凈，經(jīng)75%乙醇消毒30s，0.1%HgCl2溶液浸泡8min，無菌水沖洗3-5次后，取葉片近中脈處，切成0.5cm2小塊，接種到培養(yǎng)基上（MS+0.5mg/L6-BA，附加3%蔗糖，0.8%瓊脂，PH5.8），每瓶接種3-5片。（2）放入光強(qiáng)2000-3000lx，16h/d培養(yǎng)室培養(yǎng)。10d后觀察外植體不定芽的再生情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析叢生芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)：（1）愈傷組織的形成將切成小塊的外植體接種于MS培養(yǎng)基上最初植物組織在培養(yǎng)基上，葉片經(jīng)10d左右葉片邊緣傷口處出現(xiàn)少許黃色泡狀，泡狀形成黃綠色瘤狀突起，即為愈傷組織。（如圖1）由圖片可以看出植物愈傷組織生長較快，經(jīng)過4天時(shí)間愈傷組織體積明顯增大（如圖2）此時(shí)愈傷組織為綠色，表面粗糙，結(jié)構(gòu)松脆。由圖1到圖2所示的變化可以看出圖1此時(shí)屬于愈傷組織形成過程中的誘導(dǎo)期。外植體細(xì)胞大小雖然沒有太多的變化，但細(xì)胞內(nèi)合成代謝活躍。經(jīng)過誘導(dǎo)期以后到圖2所示階段為分裂期，外植體外層細(xì)胞開始迅速分裂。短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目成倍增長。隨后愈傷組織進(jìn)入形成期，細(xì)胞分裂由原來的局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂，結(jié)果形成瘤狀或片狀的擬分生組織，稱作組織分生節(jié)。（如圖3）10月31日10月31日圖111月4日11月4日圖211月11日11月11日圖3（2）愈傷組織再分化經(jīng)過20天左右愈傷組織開始分化出芽（如圖4），并在10天左右的時(shí)間內(nèi)分化出大量的不定芽，但由于培養(yǎng)基內(nèi)未加入生長素只加入了細(xì)胞分裂素6-BA，因此植株僅分化出了芽而未分化出根。由圖（5-7）可以看出不定芽生長狀況較好，數(shù)目較多?？偨Y(jié)經(jīng)過將近1.5個(gè)月的植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，成功的將將煙草組織