豬鏈球菌病多價滅活疫苗安全性及免疫原性試驗

豬鏈球菌病多價滅活疫苗安全性及免疫原性試驗

豬的鏈感染已成為豬世界的傳染病。在國外,多由D群鏈球菌的某些血清型特別是2型豬鏈球菌(Streptococcisuis)引起豬的敗血型和腦炎型鏈球菌病。而在國內(nèi)對豬鏈球菌致病菌的研究證實,以C群的獸疫鏈球菌為主,D群較少,E群鏈球菌則引起慢性鏈球菌病的關(guān)節(jié)炎和淋巴結(jié)炎(膿腫)。近幾年來我們發(fā)現(xiàn),有些豬場對各類豬群均進(jìn)行過鏈球菌苗的接種,但仍然大批發(fā)生鏈球菌病,造成大量死亡,后來經(jīng)過對分離的致病菌作分群鑒定,同時對發(fā)病豬群采血檢測群特異性抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫的疫苗抗原的菌群與當(dāng)時流行的菌群不符。我們通過對發(fā)病場不同類型豬群的血清學(xué)調(diào)查還發(fā)現(xiàn),一般的豬場都有2~3個致病菌群混合感染,1頭豬可以同時感染2~3個菌群,因此,僅采用某一個菌群的致病菌制造鏈球菌苗根本解決不了本病的預(yù)防問題,為此,我們從1996年開始,進(jìn)行了豬鏈球菌病多價滅活疫苗研究,通過安全性及免疫原性試驗,取得了滿意的效果,現(xiàn)將該疫苗的安全性及免疫原性試驗報告如下。1材料與方法1.1鏈球菌制苗用菌株C群SC-W1、SC-W2、SC-W3;D群SD-H2、SD-H3、SD-H4由本室從患敗血癥和腦炎的病死豬心血分離,由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所鑒定和保存。攻毒用鏈球菌菌株∶C群C55116、D群C55914均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。1.2疫苗制造按照本室擬定的《豬鏈球菌病多價滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程》(草案)制造3批疫苗,按部頒批準(zhǔn)《成品檢驗的有關(guān)規(guī)定》進(jìn)行各項檢驗合格后用于本試驗。1.3試驗豬選自武漢地區(qū)某種豬場純種斷奶仔豬20頭(2~3月齡);30~40kg重的育肥豬24頭;懷孕10~30天頭胎母豬18頭。入試前經(jīng)鏈球菌群抗體檢測均為陰性,并分別接種過下列諸病疫苗:豬瘟、豬丹毒、豬肺疫、偽狂犬病、乙型腦炎、細(xì)小病毒病等。在經(jīng)過嚴(yán)格消毒的隔離環(huán)境中進(jìn)行試驗。1.4菌血癥檢測方法采用0.1%肝素鈉抗凝,在采血樣瓶中盛入1/10容量的肝素鈉液,血樣接種于緩沖馬丁肉湯和血瓊脂平板放37℃培養(yǎng)18~24h,檢測培養(yǎng)物中有否鏈球菌。1.5血清中群特異性抗體檢測方法采用IHA法(另有專題報告),血清在1∶64呈現(xiàn)“++”判為陽性反應(yīng)。2結(jié)果2.1安全試驗2.1.1小鼠安全試驗3批疫苗分別抽樣各接種5只18~20g小鼠,每只腹腔注射0.5ml,觀察2周,全部健活。2.1.2育肥豬安全試驗3批疫苗各接種于5頭育肥豬,每頭肌注5~10ml,每批組設(shè)3頭非免疫同居感染對照。接種后2、3天檢測菌血癥,連續(xù)觀察1個月。試驗豬未發(fā)生任何不良臨床反應(yīng),未查出菌血癥;對照豬未發(fā)生同居感染。試驗豬免疫后10~15天血清抗體轉(zhuǎn)陽,21~28天達(dá)到高峰,而對照豬血清抗體始終保持陰性。2.1.3妊娠母豬安全試驗3批疫苗分別接種懷孕10~30天的頭胎母豬各5頭,每頭肌肉注射5~10ml,接種后2、3天檢測菌血癥,并繼續(xù)觀察到分娩,統(tǒng)計生產(chǎn)成績。結(jié)果顯示,3批組無一例查出菌血癥。懷孕期間未流產(chǎn),均按預(yù)產(chǎn)期產(chǎn)下活仔。2.2疫苗的免疫原性試驗及免疫持續(xù)期試驗2.2.1免疫豬的抗體反應(yīng)及其持續(xù)期3批疫苗各免疫5頭斷奶仔豬,間隔15天接種2次,每次肌肉注射2ml。另設(shè)5頭非免疫豬作對照。于第一次免疫后7天、14天、28天、3個月、6個月、9個月、12個月分別檢測血清中C、D群抗體,以便了解疫苗的免疫原性及免疫持續(xù)期。詳見表1。表1顯示,免疫后14天抗體轉(zhuǎn)陽,28天達(dá)到高峰,并能持續(xù)3個月不下降,半年仍保持較高的陽性水平,但到9個月時兩群抗體均降至陽性標(biāo)準(zhǔn)以下了,結(jié)果表明,該疫苗的免疫持續(xù)期不少于6個月。2.3疫苗的免疫效力試驗(小鼠模型效力試驗)2.3.1小鼠最小致死量測定將制苗用和攻毒用菌種分別用生理鹽水稀釋成含菌量每毫升為1×108、1×109、2×109的菌液,每個濃度接種5只8周齡昆明小鼠,每只腹腔注射1ml;另設(shè)一組生理鹽水對照組5只,途徑、劑量同前。接種后觀察1周,結(jié)果詳見表2。6個菌種的最小致死量均為109(10億)個菌。2.3.2免疫小鼠攻毒效力試驗3批疫苗各免疫6周齡小鼠20只,每批設(shè)20只對照鼠。試驗組每只腹腔接種原苗0.5ml,對照組腹腔注射生理鹽水0.5ml。觀察2周后攻擊強(qiáng)毒。每批試驗組和對照組各取一半小鼠腹腔注射C55116株,另一半攻擊D55914株,劑量均為2×109即1ml含20億個菌,觀察10天,統(tǒng)計小鼠保護(hù)和死亡數(shù)。通過保護(hù)率計算公式求出疫苗的保護(hù)率。疫苗保護(hù)率=對照組死亡數(shù)?試驗組死亡數(shù)對照組死亡數(shù)×100%=對照組死亡數(shù)-試驗組死亡數(shù)對照組死亡數(shù)×100%C群保護(hù)率=30?030×100%=3030×100%=100%=30-030×100%=3030×100%=100%D群保護(hù)率同C群。2.4疫苗保存期測定將3批疫苗分別存放在2~8℃和18℃~22℃,到6個月和12個月分別取出免疫健康家兔和斷奶仔豬,于接種后2、4周同步分別檢測家兔和豬的C、D群IHA抗體,結(jié)果顯示,在18℃~22℃保存6個月和2℃~8℃保存12個月,家兔和豬的群特異性抗體仍然保持在陽性水平(≥64),說明該疫苗的保存期在18℃~22℃為6個月,2℃~8℃不少于12個月。3小結(jié)與討論3.1通過3批疫苗以5~10ml劑量免疫育肥豬和妊娠10~30天頭胎母豬,均無不良臨床反應(yīng),不產(chǎn)生菌血癥,與對照豬同欄飼養(yǎng)不發(fā)生同居感染,疫苗具有良好的安全性。3.2本研究采用小鼠作致病性鏈球菌的動物模型進(jìn)行疫苗的免疫效力試驗。按照MizanuKebede等(1990)成功地建立的小鼠模型,選用6周齡小鼠作效力試驗。我們參照上述資料,以鏈球菌對小鼠的2個最小致死量(每毫升20億個菌)作為制造疫苗的含菌量,同時也以此劑量作為攻擊免疫小鼠的攻毒劑量,獲得了100%保護(hù)。在用于豬免疫的疫苗,我們以每毫升30億個菌的含菌量的滅活疫苗免疫豬,經(jīng)抗體檢測能產(chǎn)生較強(qiáng)免疫抗體反應(yīng)。通過免疫