第二章之種子培養(yǎng)

第二章之種子培養(yǎng)第1頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)種子制備工藝

實驗室準備階段生產(chǎn)車間階段放罐，后處理產(chǎn)品第2頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月一級種子發(fā)酵罐二級種子發(fā)酵罐第6頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月種子擴大培養(yǎng)概念：將保存在砂土管、冷涼干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。第8頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

種子質(zhì)量的優(yōu)劣對發(fā)酵生產(chǎn)起關鍵作用。其生產(chǎn)方法與條件隨不同的生產(chǎn)品種和菌種種類而異。發(fā)酵罐(幾十或幾百立方米)按10%接種量種子液(幾或幾十立方米)由實驗室制備到車間生產(chǎn)的過程第9頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月作為種子的要求：1)菌種活力強，移種后能迅速生長，遲緩期短2)生理性狀穩(wěn)定3)菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求4)無雜菌污染5)保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力第10頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實驗室種子制備接入斜面/平板，培養(yǎng)成熟后，挑選孢子，再一次接入斜面/平板，進行活化。(兩次轉(zhuǎn)接)A、砂土管或冷凍干燥管菌種活化第11頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

可采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，直接作為種子罐的種子。

舉例:產(chǎn)黃青霉菌，采用大米或小米為固體培養(yǎng)基，裝入搖瓶、滅菌，耍注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28℃培養(yǎng)14d。培養(yǎng)結(jié)束，將孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10％以下，冰箱保存?zhèn)溆?。B、產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種第12頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月可以用搖瓶液體培養(yǎng)法，孢子接入液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。

例如：灰色鏈霉菌、卡那鏈霉菌。C、產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種第13頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月生產(chǎn)上一般采用斜面營養(yǎng)細胞保藏法。斜面菌種于32℃，培養(yǎng)18-24h，即可移入250mL搖瓶液體培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)12h，即可作種子罐種子。

例如：谷氨酸棒狀桿菌。D、不產(chǎn)孢子的細菌第14頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月一般保存在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基或MYPG培養(yǎng)基的斜面上，4℃冰箱保存.每年移種3-4次。斜面菌種→接入含10mL麥芽汁試管→25-27℃培養(yǎng)2-3d→擴大至三角瓶→25℃培養(yǎng)2d→移至含5-10L麥芽汁的罐→15-20℃培養(yǎng)3-5d→含100L麥芽汁的發(fā)酵罐。E、生產(chǎn)啤酒的酵母菌MYPG培養(yǎng)基：3g麥芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨,10g葡萄糖,20g瓊脂,1L水。第15頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月二、生產(chǎn)車間種子制備采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米槳、磷酸鹽等，同時還需供給足夠的無菌空氣并不斷攪拌，使菌絲體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。種子罐培養(yǎng)原則：第16頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月?lián)u瓶菌絲體種子：種子罐之間或發(fā)酵罐間的移種：接種方法：可在火焰保護下接入種子罐或采用壓差法接入。主要采用壓差法，由種子接種管道進行移種，移種過程中要防止接受罐表壓降至零.Why?第17頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種種子罐種子罐種子罐第18頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月從種子罐接種到發(fā)酵罐第19頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月生產(chǎn)車間種子制備工藝可控參數(shù):種子罐級數(shù)種齡接種量第20頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月A種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)指制備種子需擴大培養(yǎng)的次數(shù).種子罐級數(shù)的意義：

種子罐級數(shù)越少，越有利于簡化工藝和控制，并可減少移種帶來染菌機會。但也必須考慮盡量延長發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時間，縮短由于種子發(fā)芽、生長而占用的非生產(chǎn)時間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。因此，種子罐級數(shù)不宜過少。第21頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

種子罐級數(shù)隨菌種及規(guī)模而定，也與工藝條件有關。優(yōu)化種子罐培養(yǎng)條件，加速孢子發(fā)芽及菌體繁殖，也可減少種子罐的級數(shù)。第22頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月1、生長快的細菌，種子用量少，種子罐相應也少。

例如：谷氨酸生產(chǎn)中，菌接入種子罐32℃培養(yǎng)7一10h，即可接入發(fā)酵罐作為種子，這稱為一級種子罐擴大培養(yǎng)，也稱二級發(fā)酵。第23頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2、生長較慢的菌種，種子用量大，種子罐相應也多。

例如：青霉素孢子懸液接入一級種子罐（發(fā)芽罐）于27℃培養(yǎng)40h，孢子發(fā)芽，長出短菌絲。再移至第二級種子罐（繁殖罐），27℃培養(yǎng)10-24h，菌絲迅速繁殖，獲粗壯菌體，即可移至發(fā)酵罐，這稱為二級種子罐擴大培養(yǎng)，也稱三級發(fā)酵。一般50m3發(fā)酵罐都采用三級發(fā)酵。

第24頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.生長更慢的菌種

鏈霉素生產(chǎn)菌種灰色鏈霉菌，一般采用三級種子罐擴大培養(yǎng)。在小型發(fā)酵罐(5—30L)進行試驗時，也有采用直接孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，稱一級發(fā)酵。第25頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

接種齡以菌絲處于對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時，較為合適。

過于年輕的種子：前期生長緩慢、發(fā)酵周期延長、產(chǎn)物形成推遲，甚至會因菌絲量過少而在發(fā)酵罐內(nèi)結(jié)球，造成異常發(fā)酵的情況。

過老的種子：會引起生產(chǎn)能力下降，菌絲過早自溶。

不同品種或同一品種的工藝條件不同，接種齡是不一樣的，要經(jīng)試驗，確定最適接種齡。B接種齡第26頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。第27頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量大小決定于菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。

例如：抗生素發(fā)酵的最適接種量為7-15％，有時可增加到20-25％。而谷氨酸發(fā)酵只需1％。C.接種量第28頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月大接種量：可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖到達高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前，且生產(chǎn)菌迅速繁殖，可減少雜菌生長機會。

原因：??(a、種子量多b、種子液含大量水解酶類，利于利用基質(zhì))接種量過多：

往往使菌絲生長過快、培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧不足，而影響產(chǎn)物的合成。第29頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶：1％接種量產(chǎn)酶活力最高，超過4％酶產(chǎn)量明顯下降。第30頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月接種量過小：

除了延長發(fā)酵周期外，往往還會引起其他不正常情況。

例如：在頭孢菌素生產(chǎn)中，由于接種量過小，會產(chǎn)生大量菌絲團，而使產(chǎn)量降低，

但有的抗生素如制霉菌素，用1％接種量比用10％接種量的效果好，而0.1％接種量與1％的效果相似。第31頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

近年來，生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施。

雙種法：有的產(chǎn)品采用二只種子罐接一只發(fā)酵罐，如卡那霉素生產(chǎn)中采用雙種比單種的發(fā)酵單位提高8％，而且達到產(chǎn)量高峰的時間提前。

倒種法：即以適宜的發(fā)酵液倒出適量，給另一發(fā)酵罐作種子．例如鏈霉素發(fā)酵中，使用倒種法比單種的發(fā)酵單位提高12％。而四環(huán)素發(fā)酵采用雙種效果并不顯著。第32頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月影響種子質(zhì)量的因素種子質(zhì)量的判斷種子質(zhì)量的控制第二節(jié)種子質(zhì)量的控制第33頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月A原材料質(zhì)量

生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。(什么引起原料質(zhì)量波動?)

影響種子質(zhì)量的因素答：原材料質(zhì)量的波動，起主要作用的是無機離子含量不同，如微量元素鎂、銅、鋇能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。

第34頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月例1：四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。例2：制備霉菌用的大(小)米，其產(chǎn)地、顆粒大小、均勻程度不同，孢子質(zhì)量也不同。

例3：蛋白胨加工原料不同，對孢子影響也不同。

例4：瓊脂的牌號不同，其中含無機離子的差別而引起孢子質(zhì)量的變化。

例5：水質(zhì)的硬度、污染程度對生產(chǎn)均有影響。第35頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

B培養(yǎng)條件

(1)溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。

例如：土霉素生產(chǎn)菌種在高于37℃培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后，表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。第36頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)濕度斜面培養(yǎng)基濕度對孢子數(shù)量和質(zhì)量有較大影響。

例如：土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子制備時發(fā)現(xiàn)：北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含少量水分的試管斜面下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干癟狀，孢子稀少。在氣溫高濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。第37頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)通氣量

種子罐有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。

例如:青霉素生產(chǎn)，將通氣充足和不足情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐，發(fā)酵單位相差1倍。

但也有例外

例如：土霉素生產(chǎn)中，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。第38頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月C斜面冷藏時間

例如：土霉素生產(chǎn)菌種，孢子斜面培養(yǎng)4d即于4℃冰箱保存，冷藏7-8d菌體細胞開始自溶。而培養(yǎng)5d以后冷藏，20d未發(fā)現(xiàn)自溶。

例如：鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18％。斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。第39頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月為保證種子質(zhì)量，除保證培養(yǎng)條件外，還要定期取樣測定一些參數(shù)，以觀察基質(zhì)的代謝變化及菌絲形態(tài)是否正常。

1).pH2).培養(yǎng)基滅菌后磷、糖、氨基氮的含量3).菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀(色素、顆粒等)4).其他參數(shù)，如接種前抗生素含量、某種酶活力等種子質(zhì)量的判斷測定的參數(shù):第40頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月用酶活力來判斷種子的質(zhì)量是一種新的嘗試：

例如：土霉素發(fā)酵中，種子液的淀粉酶活力與發(fā)酵單位有一定關系。淀粉酶活力高的，接入發(fā)酵罐后土霉素發(fā)酵單位也高，反之則低。第41頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月A菌種穩(wěn)定性的檢查生產(chǎn)菌種，必須保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，雖然菌種保