雙殼貝類中扇貝毒素和原多甲藻酸的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析

雙殼貝類中扇貝毒素和原多甲藻酸的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析

隨著海洋環(huán)境的惡化，赤潮頻繁爆發(fā)，赤潮的破壞之一是它能產(chǎn)生和分泌毒素。這些毒素經(jīng)貝類和魚類體內(nèi)蓄積通過食物鏈進(jìn)入人體,嚴(yán)重危害食用者的身體健康,甚至威脅生命。海洋貝類毒素根據(jù)其對人類引發(fā)中毒的癥狀和藻源進(jìn)行分類可分為麻痹性貝毒、腹瀉性貝毒、神經(jīng)性貝毒和記憶缺失性貝毒。如果按照化學(xué)結(jié)構(gòu)來區(qū)分,麻痹性貝毒屬于生物堿類物質(zhì),是親水性毒素,而后三種貝毒一般是親脂性的聚醚化合物。腹瀉性貝毒最初是指軟海綿酸OA和它的衍生物鰭藻毒素DTXs,隨著科研工作的不斷深入,研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新型貝類毒素。如扇貝毒素PTXs、蝦夷扇貝毒素YTXs和原多甲藻酸貝毒AZAs等在結(jié)構(gòu)、毒性上與OA有差異,但這幾種毒素成分通常在貝中與OA和DTXs共存,一直以來也被歸為腹瀉性貝類毒素。FAO/IOC/WHO于2004年3月在都柏林(Dublin)舉行的關(guān)于貝類生物毒素會議上,重新按化學(xué)結(jié)構(gòu)將貝類生物毒素分為8組,AZA2屬于原多甲藻酸(Azaspirzcids)組,PTX2屬于扇貝毒素(Pectenotoxins)組。AZAs可引起惡心、嘔吐、腹瀉、胃痙攣等中毒癥狀,PTXs雖不會引起腹瀉,但會損傷肝臟。近年來對中國沿海部分海區(qū)貝類毒素的調(diào)查顯示,中國雙殼貝類已經(jīng)受到了貝類毒素的污染。遼東灣、膠州灣、萊州灣、秦皇島、福建等海域均發(fā)現(xiàn)腹瀉性貝類毒素,對生態(tài)環(huán)境及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。我國腹瀉性貝毒的研究比較滯后,主要是使用小鼠生物法、ELISA法和高效液相色譜結(jié)合柱前或柱后衍生-熒光檢測技術(shù)檢測貝類樣品的報道。質(zhì)譜作為一種新興的高靈敏、高特異性的檢測手段,在貝類毒素的研究領(lǐng)域必將占有重要的地位。早期上海出入境檢驗(yàn)檢疫局方曉明等在貝類毒素的分析檢測上做了較多基礎(chǔ)性研究,他們利用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-TOF-MS)進(jìn)行貝類樣品的腹瀉性貝毒大田軟海綿酸、神經(jīng)性貝毒短裸甲藻毒素A、記憶缺失性貝毒軟骨藻酸的檢測研究,但在貝毒數(shù)量、樣品種類上還有待拓寬。近年來,有多位學(xué)者采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了貝類組織中的親脂性貝毒,首次發(fā)現(xiàn)了我國貝類中存在PTX-2sa,在我國北海緣齒牡蠣中發(fā)現(xiàn)了螺旋環(huán)亞胺類毒素GYM。歐盟對AZAs和PTXs的安全限量分別為160μg/kg貝類組織和150μg/kg貝類組織。但歐洲食品安全局發(fā)表研究報告建議降低AZAs的安全限量到30μg/kg貝類組織、降低OA類的安全限量到45μg/kg貝類組織。這暗示著降低貝毒的安全限量標(biāo)準(zhǔn)是全球范圍內(nèi)的趨勢,也對檢測方法的靈敏度提出了更高的挑戰(zhàn)。本文基于固相萃取純化濃縮、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS/MS)多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),測定雙殼貝類中的兩種親脂性貝毒AZA2和PTX2。通過優(yōu)化固相萃取條件,結(jié)合高靈敏的串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù),提高了分析靈敏度,使得AZA2和PTX2的檢出限分別為0.013μg/kg、0.085μg/kg,大大低于歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)值。1材料和方法1.1試驗(yàn)設(shè)備及試劑島津UFLCXR液相色譜分離系統(tǒng)(日本島津公司)、AB5500型三重四級桿質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、Millipore超純水過濾裝置(美國Millipore公司)、LegendRT型高速離心機(jī)(德國Heraeus公司)、HGC-24型氮吹儀(天津恒奧科技有限公司)、反相Shim-packXR-ODSHPLC分離柱(150mm×2.0mm)、OasisHLB3cc(60mg)固相萃取小柱(美國Waters公司)。乙腈(HPLC級,批號:124571)、甲醇(HPLC級,批號:50102)、甲酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%~100%,批號:K32719063346)均購自德國Merck公司;甲酸銨(HPLC,Tedia,批號:200287)、氨水(分析純,批號:T20121021),貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大國家研究委員會海洋生物科學(xué)研究所,其中,扇貝毒素PTX2濃度為8.6μg/ml±0.3μg/ml、原多甲藻酸AZA2濃度為1.28μg/ml±0.05μg/ml。試驗(yàn)用水均來自Milli-Q系統(tǒng)。試驗(yàn)樣品紫貽貝(淡菜)、牡蠣、扇貝購自寧波象山某菜場。1.2方法1.2.1上清液上清液的制備取貝類可食部分混合,搗勻。稱取約2g搗勻的貝類組織于15ml塑料離心管中,加入5ml甲醇,渦旋振蕩1min,靜置10min,于25℃、10000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min,離心所得的上清液轉(zhuǎn)移至25ml刻度試管中。按照上述提取步驟再重復(fù)提取2次,合并提取液,用純水定容至刻度。1.2.2掃干、洗脫OasisHLB3cc(60mg)固相萃取小柱依次用3ml甲醇、3ml水活化后,保持柱體濕潤。將上述經(jīng)水稀釋過的貝類組織提取液(水/甲醇體積比為2∶3)轉(zhuǎn)移到此活化好的小柱上,流速不能超過1滴/s,待上樣完畢,以5ml甲醇/水(體積比為1∶3)淋洗小柱,在低真空度下減壓抽干小柱,最后被分析物依次用2.5ml甲醇和2.5ml5%氨化甲醇洗脫。收集洗脫液,于40℃下用N2吹至近干,加入2ml甲醇∶水(體積比1∶1)充分溶解,用0.20μm濾膜過濾,濾液供HPLC/MS/MS測定。1.2.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制AZA2、PTX2混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液由購買的貝毒標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇/水(體積比1∶1)稀釋而得,濃度分別為25.6ng/ml、172ng/ml,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4標(biāo)準(zhǔn)儲備液pt2005稱取7份空白扇貝樣品,依照以上樣品提取和固相萃取步驟,最終得到7份2ml空白扇貝基質(zhì)提取液,往這7份空白基質(zhì)中加入不同體積AZA2、PTX2的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,得到一系列含有不同濃度AZA2和PTX2的基質(zhì)溶液,其中AZA2濃度為0.128ng/ml、0.256ng/ml、0.512ng/ml、1.024ng/ml、2.048ng/ml、4.096ng/ml、8.20ng/ml;PTX2濃度為0.86ng/ml、1.72ng/ml、3.44ng/ml、6.88ng/ml、13.76ng/ml、27.52ng/ml、55.04ng/ml;利用此基質(zhì)工作溶液繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.5流動相、線性梯度洗脫程序色譜條件色譜柱為Shim-packXR-ODS分離柱(150mm×2.0mm);柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5μl;流動相A為水相,含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸;流動相B為乙腈,含0.1%甲酸,線性梯度洗脫程序:0.00min~5.00min,20%B~70%B;5.00min~6.00min,70%B~85%B;6.00min~8.00min,85%B;8.00min~9.00min,85%B~20%B;5.00min~10.00min,20%B。流速:0.4ml/min。2結(jié)果與討論2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化根據(jù)待測物的性質(zhì),配制AZA2和PTX2濃度分別為25.6ng/ml、172ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑為含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸的甲醇/水(1∶1,V/V)),采用注射泵進(jìn)樣的方式進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AZA2和PTX2在ESI正離子模式下質(zhì)譜信號強(qiáng),通過母離子掃描分析,確定AZA2的母離子為[M+H]+,PTX2的母離子為[M+NH4]+。對選定的母離子進(jìn)行子離子掃描,選取豐度相對最強(qiáng)的子離子為定量離子,其次的為定性離子,再分別對子離子的碰撞能進(jìn)行了優(yōu)化,最后采用多反應(yīng)監(jiān)測模式對待測物進(jìn)行定性和定量分析。色譜分離方面,選取反相ODS分離柱有利于親脂性貝毒的保留,同時選取含2mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸的水相A及含0.1%甲酸的乙腈溶液作為流動相,較之單純以乙腈水作為流動相,離子化效率高,峰形好。提高有機(jī)相比例有利于目標(biāo)分析物的流出,但粗提取液里的雜質(zhì)也一并流出。通過設(shè)置梯度洗脫,在低比例有機(jī)相的條件下先洗脫出親水性的雜質(zhì),待目標(biāo)分析物流出后,提高有機(jī)相比例,把粗提取液中的強(qiáng)疏水性雜質(zhì)洗脫下來,這樣可更有效地排除干擾。圖1為兩種親脂性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化的HPLC/MS/MS條件下得到的MRM圖譜。2.2固相萃取條件的優(yōu)化2.2.1樣品的采集和測定OasisHLB固相萃取小柱廣泛應(yīng)用于酸性、中性及堿性化合物的純化濃縮,可以預(yù)測OasisHLB小柱對AZA2和PTX2具有良好的吸附效果。在試驗(yàn)中,貝類樣品經(jīng)由甲醇提取,所得到的甲醇提取液如果直接上樣,目標(biāo)分析物即隨著甲醇一起流出柱外,回收率幾乎為零。所以,尤為重要的一點(diǎn)是確定上樣溶液中水的比例,以保證目標(biāo)分析物在萃取小柱上完全保留。具體步驟如下:1.5ml含水百分比分別為0%、25%、35%、40%、50%和75%的PTX2(3.44ng/ml)和AZA2(0.51ng/ml)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣到已活化好的小柱上,用1ml水淋洗,抽至近干,再用3ml甲醇洗脫。分別收集上樣濾出液、淋洗液和洗脫液,量出它們的精確體積,與相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液峰強(qiáng)對比,計(jì)算出上樣濾出液、淋洗液和洗脫液中所含目標(biāo)分析物的百分比,百分比數(shù)據(jù)已列于表1中。從表1中可以看出,采用純甲醇溶液直接上樣,在上樣濾出液和淋洗液中檢測到絕大部分目標(biāo)分析物,而洗脫液中的目標(biāo)分析物幾乎可忽略不計(jì),這表明甲醇溶液中的目標(biāo)分析物基本未被吸附到小柱上。升高上樣溶液中水的比例到25%,上樣濾出液中仍能檢測到7%的AZA2,當(dāng)水的比例升高到35%時,上樣濾出液和淋洗液中均未檢測到AZA2和PTX2,但洗脫液中的含量劇增,繼續(xù)升高上樣液中水的含量到40%,洗脫液中目標(biāo)分析物仍有增加,當(dāng)增加到一定程度后,洗脫液中目標(biāo)分析物的含量基本不變。最終,我們將樣品提取液稀釋成含水40%的溶液再上樣,保證100%上樣率。2.2.2淋洗液的選擇淋洗可去除柱上保留的鹽類和強(qiáng)極性的物質(zhì),一般采用低有機(jī)相的淋洗液來去除雜質(zhì)。從上述上樣液的優(yōu)化過程來看,含水比例大于40%的上樣液即可完全避免被分析物在柱上的損失,理論上采用含水百分比為40%的甲醇水溶液作為淋洗液使被分析物不會造成損失。保險起見,試驗(yàn)中選擇甲醇/水(1︰3,含水百分比為75%)的溶液作為淋洗液。洗脫過程中,對于HLB小柱一般采用純甲醇溶液作為洗脫液,但對于胺類化合物,像AZA2,最好選擇弱堿性洗脫液。試驗(yàn)中考察了5ml純甲醇(A)、2.5ml甲醇+2.5ml1%氨化甲醇(B)、5ml1%氨化甲醇(C)作為洗脫液對目標(biāo)分析物回收率的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示,三種洗脫液都對AZA2和PTX2有著良好的洗脫效果(回收率>90%),其中B和C優(yōu)于A,為了更有利于溶劑的揮發(fā),折中選擇B作為洗脫液。2.3基質(zhì)效應(yīng)的考察試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)試樣經(jīng)過SPE小柱凈化濃縮后,存在一定的基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)的消除和校正方法一般有內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法以及一些樣品凈化和改變色譜分離條件的方法。本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法來考察樣品中基質(zhì)對目標(biāo)分析物的影響:往經(jīng)過SPE純化濃縮后的空白基質(zhì)中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,所得的響應(yīng)值與同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值比較,即可分析PTX2和AZA2在樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明,樣品基質(zhì)對目標(biāo)分析物具有一定的基質(zhì)抑制效應(yīng),通過計(jì)算得出PTX2和AZA2的基質(zhì)抑制效應(yīng)分別為45%、22%。另外,還考察了未經(jīng)過SPE純化濃縮的粗提取液對分析物所造成的基質(zhì)效應(yīng),發(fā)現(xiàn)粗提取液中的基質(zhì)對目標(biāo)分析物的響應(yīng)值幾乎無影響。說明SPE純化濃縮目標(biāo)分析物的同時基質(zhì)也被濃縮,濃縮后的基質(zhì)對目標(biāo)物造成了基質(zhì)抑制效應(yīng)。由于基質(zhì)抑制效應(yīng)引起的靈敏度下降抵消了一部分由濃縮所提高的靈敏度,試驗(yàn)中只要滿足SPE的濃縮倍數(shù)超過2即有利于提高整個方法的靈敏度。本試驗(yàn)中SPE的濃縮倍數(shù)是7.5(15ml→2ml),結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜檢測,使方法檢出限達(dá)到0.013μg/kg~0.085μg/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐盟限值。2.4方法學(xué)參數(shù)2.4.1線性范圍和定量限在優(yōu)化的前處理和HPLC/MS/MS條件下,對本法配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定,以各分析物的定量離子的峰面積y對其在溶液中的濃度x(ng/ml)進(jìn)行線性擬合,得到PTX2和AZA2在基質(zhì)溶液中的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。采用在空白基質(zhì)添加目標(biāo)組分的方法,依據(jù)色譜峰的信噪比(S/N)等于3確定檢出限(LOD),S/N等于10確定定量限(LOQ),數(shù)據(jù)見表2。兩種分析物在低濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999;PTX2和AZA2的LOQ達(dá)到0.28ng/ml和0.043ng/ml。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作依據(jù)歐盟非強(qiáng)制執(zhí)行法案2002/657/EC的要求,如果不具備標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)作為方法驗(yàn)證對象的條件,則需進(jìn)行方法加標(biāo)回收試驗(yàn)。本方法采用不含待測物的扇貝作為空白樣品,分別加入3種不同濃度水平(低、中、高)的PTX2和AZA2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,放置過夜。次日按照以上SPE操作步驟進(jìn)行樣品預(yù)處理,測得分析物的峰面積按照基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出它們相應(yīng)濃度,此濃度與加入量比較,比值即為回收率,結(jié)果見表3。從表中不難看出,此方法在低中高不同添加水平上都具有理想的加標(biāo)回收率。2.4.3方法的標(biāo)準(zhǔn)測定空白扇貝基質(zhì)中加入PTX2(3.44ng/ml)、AZA2(0.512ng/ml),平行測定6次,得到PTX2、AZA2的日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.5%、6.7%;連續(xù)5d對此加標(biāo)樣品進(jìn)行測定,并平行測定3次,得到PTX2、AZA2的日間標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.8%、9.5%。加標(biāo)扇貝樣品平均分成6份,按照所建立的方法測定其中兩種貝類毒素的含量,得到方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果顯示兩種貝類毒素的RSD均<7%,說明此方法具有良好的重復(fù)性。2.5樣品的測定應(yīng)用本研究所建立的方法對寧波象山港一帶市售的60份雙殼貝類,包括扇貝、貽貝及牡蠣樣品進(jìn)行了分析。其中有兩份貽貝中檢出了AZA2,濃度為0.035μg/kg;一份牡蠣樣品中檢出了PTX2,其濃度為0.4μg/kg;所測定的20份扇貝中均未檢測到AZA2和PTX2?？傮w來看,AZ