雙殼貝類中扇貝毒素和原多甲藻酸的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法分析

雙殼貝類中扇貝毒素和原多甲藻酸的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法分析

隨著海洋環(huán)境的惡化，赤潮頻繁爆發(fā)，赤潮的破壞之一是它能產(chǎn)生和分泌毒素。這些毒素經(jīng)貝類和魚類體內(nèi)蓄積通過食物鏈進入人體,嚴重危害食用者的身體健康,甚至威脅生命。海洋貝類毒素根據(jù)其對人類引發(fā)中毒的癥狀和藻源進行分類可分為麻痹性貝毒、腹瀉性貝毒、神經(jīng)性貝毒和記憶缺失性貝毒。如果按照化學結構來區(qū)分,麻痹性貝毒屬于生物堿類物質,是親水性毒素,而后三種貝毒一般是親脂性的聚醚化合物。腹瀉性貝毒最初是指軟海綿酸OA和它的衍生物鰭藻毒素DTXs,隨著科研工作的不斷深入,研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新型貝類毒素。如扇貝毒素PTXs、蝦夷扇貝毒素YTXs和原多甲藻酸貝毒AZAs等在結構、毒性上與OA有差異,但這幾種毒素成分通常在貝中與OA和DTXs共存,一直以來也被歸為腹瀉性貝類毒素。FAO/IOC/WHO于2004年3月在都柏林(Dublin)舉行的關于貝類生物毒素會議上,重新按化學結構將貝類生物毒素分為8組,AZA2屬于原多甲藻酸(Azaspirzcids)組,PTX2屬于扇貝毒素(Pectenotoxins)組。AZAs可引起惡心、嘔吐、腹瀉、胃痙攣等中毒癥狀,PTXs雖不會引起腹瀉,但會損傷肝臟。近年來對中國沿海部分海區(qū)貝類毒素的調(diào)查顯示,中國雙殼貝類已經(jīng)受到了貝類毒素的污染。遼東灣、膠州灣、萊州灣、秦皇島、福建等海域均發(fā)現(xiàn)腹瀉性貝類毒素,對生態(tài)環(huán)境及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的威脅。我國腹瀉性貝毒的研究比較滯后,主要是使用小鼠生物法、ELISA法和高效液相色譜結合柱前或柱后衍生-熒光檢測技術檢測貝類樣品的報道。質譜作為一種新興的高靈敏、高特異性的檢測手段,在貝類毒素的研究領域必將占有重要的地位。早期上海出入境檢驗檢疫局方曉明等在貝類毒素的分析檢測上做了較多基礎性研究,他們利用液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用技術(LC-TOF-MS)進行貝類樣品的腹瀉性貝毒大田軟海綿酸、神經(jīng)性貝毒短裸甲藻毒素A、記憶缺失性貝毒軟骨藻酸的檢測研究,但在貝毒數(shù)量、樣品種類上還有待拓寬。近年來,有多位學者采用液相色譜質譜聯(lián)用技術分析了貝類組織中的親脂性貝毒,首次發(fā)現(xiàn)了我國貝類中存在PTX-2sa,在我國北海緣齒牡蠣中發(fā)現(xiàn)了螺旋環(huán)亞胺類毒素GYM。歐盟對AZAs和PTXs的安全限量分別為160μg/kg貝類組織和150μg/kg貝類組織。但歐洲食品安全局發(fā)表研究報告建議降低AZAs的安全限量到30μg/kg貝類組織、降低OA類的安全限量到45μg/kg貝類組織。這暗示著降低貝毒的安全限量標準是全球范圍內(nèi)的趨勢,也對檢測方法的靈敏度提出了更高的挑戰(zhàn)。本文基于固相萃取純化濃縮、液相色譜串聯(lián)質譜(HPLC/MS/MS)多反應監(jiān)測模式(MRM),測定雙殼貝類中的兩種親脂性貝毒AZA2和PTX2。通過優(yōu)化固相萃取條件,結合高靈敏的串聯(lián)質譜檢測技術,提高了分析靈敏度,使得AZA2和PTX2的檢出限分別為0.013μg/kg、0.085μg/kg,大大低于歐盟的限量標準和相關文獻值。1材料和方法1.1試驗設備及試劑島津UFLCXR液相色譜分離系統(tǒng)(日本島津公司)、AB5500型三重四級桿質譜儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)、Millipore超純水過濾裝置(美國Millipore公司)、LegendRT型高速離心機(德國Heraeus公司)、HGC-24型氮吹儀(天津恒奧科技有限公司)、反相Shim-packXR-ODSHPLC分離柱(150mm×2.0mm)、OasisHLB3cc(60mg)固相萃取小柱(美國Waters公司)。乙腈(HPLC級,批號:124571)、甲醇(HPLC級,批號:50102)、甲酸(質量分數(shù)98%~100%,批號:K32719063346)均購自德國Merck公司;甲酸銨(HPLC,Tedia,批號:200287)、氨水(分析純,批號:T20121021),貝類毒素標準品購自加拿大國家研究委員會海洋生物科學研究所,其中,扇貝毒素PTX2濃度為8.6μg/ml±0.3μg/ml、原多甲藻酸AZA2濃度為1.28μg/ml±0.05μg/ml。試驗用水均來自Milli-Q系統(tǒng)。試驗樣品紫貽貝(淡菜)、牡蠣、扇貝購自寧波象山某菜場。1.2方法1.2.1上清液上清液的制備取貝類可食部分混合,搗勻。稱取約2g搗勻的貝類組織于15ml塑料離心管中,加入5ml甲醇,渦旋振蕩1min,靜置10min,于25℃、10000r/min轉速下離心5min,離心所得的上清液轉移至25ml刻度試管中。按照上述提取步驟再重復提取2次,合并提取液,用純水定容至刻度。1.2.2掃干、洗脫OasisHLB3cc(60mg)固相萃取小柱依次用3ml甲醇、3ml水活化后,保持柱體濕潤。將上述經(jīng)水稀釋過的貝類組織提取液(水/甲醇體積比為2∶3)轉移到此活化好的小柱上,流速不能超過1滴/s,待上樣完畢,以5ml甲醇/水(體積比為1∶3)淋洗小柱,在低真空度下減壓抽干小柱,最后被分析物依次用2.5ml甲醇和2.5ml5%氨化甲醇洗脫。收集洗脫液,于40℃下用N2吹至近干,加入2ml甲醇∶水(體積比1∶1)充分溶解,用0.20μm濾膜過濾,濾液供HPLC/MS/MS測定。1.2.3標準品溶液配制AZA2、PTX2混合標準儲備液由購買的貝毒標準品以甲醇/水(體積比1∶1)稀釋而得,濃度分別為25.6ng/ml、172ng/ml,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4標準儲備液pt2005稱取7份空白扇貝樣品,依照以上樣品提取和固相萃取步驟,最終得到7份2ml空白扇貝基質提取液,往這7份空白基質中加入不同體積AZA2、PTX2的混合標準儲備液,得到一系列含有不同濃度AZA2和PTX2的基質溶液,其中AZA2濃度為0.128ng/ml、0.256ng/ml、0.512ng/ml、1.024ng/ml、2.048ng/ml、4.096ng/ml、8.20ng/ml;PTX2濃度為0.86ng/ml、1.72ng/ml、3.44ng/ml、6.88ng/ml、13.76ng/ml、27.52ng/ml、55.04ng/ml;利用此基質工作溶液繪制基質匹配標準曲線。1.2.5流動相、線性梯度洗脫程序色譜條件色譜柱為Shim-packXR-ODS分離柱(150mm×2.0mm);柱溫:40℃;進樣量:5μl;流動相A為水相,含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸;流動相B為乙腈,含0.1%甲酸,線性梯度洗脫程序:0.00min~5.00min,20%B~70%B;5.00min~6.00min,70%B~85%B;6.00min~8.00min,85%B;8.00min~9.00min,85%B~20%B;5.00min~10.00min,20%B。流速:0.4ml/min。2結果與討論2.1質譜條件優(yōu)化根據(jù)待測物的性質,配制AZA2和PTX2濃度分別為25.6ng/ml、172ng/ml的標準溶液(溶劑為含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸的甲醇/水(1∶1,V/V)),采用注射泵進樣的方式進行質譜條件優(yōu)化。試驗發(fā)現(xiàn),AZA2和PTX2在ESI正離子模式下質譜信號強,通過母離子掃描分析,確定AZA2的母離子為[M+H]+,PTX2的母離子為[M+NH4]+。對選定的母離子進行子離子掃描,選取豐度相對最強的子離子為定量離子,其次的為定性離子,再分別對子離子的碰撞能進行了優(yōu)化,最后采用多反應監(jiān)測模式對待測物進行定性和定量分析。色譜分離方面,選取反相ODS分離柱有利于親脂性貝毒的保留,同時選取含2mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸的水相A及含0.1%甲酸的乙腈溶液作為流動相,較之單純以乙腈水作為流動相,離子化效率高,峰形好。提高有機相比例有利于目標分析物的流出,但粗提取液里的雜質也一并流出。通過設置梯度洗脫,在低比例有機相的條件下先洗脫出親水性的雜質,待目標分析物流出后,提高有機相比例,把粗提取液中的強疏水性雜質洗脫下來,這樣可更有效地排除干擾。圖1為兩種親脂性貝類毒素標準溶液在優(yōu)化的HPLC/MS/MS條件下得到的MRM圖譜。2.2固相萃取條件的優(yōu)化2.2.1樣品的采集和測定OasisHLB固相萃取小柱廣泛應用于酸性、中性及堿性化合物的純化濃縮,可以預測OasisHLB小柱對AZA2和PTX2具有良好的吸附效果。在試驗中,貝類樣品經(jīng)由甲醇提取,所得到的甲醇提取液如果直接上樣,目標分析物即隨著甲醇一起流出柱外,回收率幾乎為零。所以,尤為重要的一點是確定上樣溶液中水的比例,以保證目標分析物在萃取小柱上完全保留。具體步驟如下:1.5ml含水百分比分別為0%、25%、35%、40%、50%和75%的PTX2(3.44ng/ml)和AZA2(0.51ng/ml)的混合標準溶液上樣到已活化好的小柱上,用1ml水淋洗,抽至近干,再用3ml甲醇洗脫。分別收集上樣濾出液、淋洗液和洗脫液,量出它們的精確體積,與相同濃度的混合標準溶液峰強對比,計算出上樣濾出液、淋洗液和洗脫液中所含目標分析物的百分比,百分比數(shù)據(jù)已列于表1中。從表1中可以看出,采用純甲醇溶液直接上樣,在上樣濾出液和淋洗液中檢測到絕大部分目標分析物,而洗脫液中的目標分析物幾乎可忽略不計,這表明甲醇溶液中的目標分析物基本未被吸附到小柱上。升高上樣溶液中水的比例到25%,上樣濾出液中仍能檢測到7%的AZA2,當水的比例升高到35%時,上樣濾出液和淋洗液中均未檢測到AZA2和PTX2,但洗脫液中的含量劇增,繼續(xù)升高上樣液中水的含量到40%,洗脫液中目標分析物仍有增加,當增加到一定程度后,洗脫液中目標分析物的含量基本不變。最終,我們將樣品提取液稀釋成含水40%的溶液再上樣,保證100%上樣率。2.2.2淋洗液的選擇淋洗可去除柱上保留的鹽類和強極性的物質,一般采用低有機相的淋洗液來去除雜質。從上述上樣液的優(yōu)化過程來看,含水比例大于40%的上樣液即可完全避免被分析物在柱上的損失,理論上采用含水百分比為40%的甲醇水溶液作為淋洗液使被分析物不會造成損失。保險起見,試驗中選擇甲醇/水(1︰3,含水百分比為75%)的溶液作為淋洗液。洗脫過程中,對于HLB小柱一般采用純甲醇溶液作為洗脫液,但對于胺類化合物,像AZA2,最好選擇弱堿性洗脫液。試驗中考察了5ml純甲醇(A)、2.5ml甲醇+2.5ml1%氨化甲醇(B)、5ml1%氨化甲醇(C)作為洗脫液對目標分析物回收率的影響。試驗結果顯示,三種洗脫液都對AZA2和PTX2有著良好的洗脫效果(回收率>90%),其中B和C優(yōu)于A,為了更有利于溶劑的揮發(fā),折中選擇B作為洗脫液。2.3基質效應的考察試驗中發(fā)現(xiàn)試樣經(jīng)過SPE小柱凈化濃縮后,存在一定的基質效應?；|效應的消除和校正方法一般有內(nèi)標法、標準加入法、基質匹配標準曲線法以及一些樣品凈化和改變色譜分離條件的方法。本試驗采用標準加入法來考察樣品中基質對目標分析物的影響:往經(jīng)過SPE純化濃縮后的空白基質中加入混合標準溶液,所得的響應值與同濃度標準溶液的響應值比較,即可分析PTX2和AZA2在樣品中的基質效應。試驗結果表明,樣品基質對目標分析物具有一定的基質抑制效應,通過計算得出PTX2和AZA2的基質抑制效應分別為45%、22%。另外,還考察了未經(jīng)過SPE純化濃縮的粗提取液對分析物所造成的基質效應,發(fā)現(xiàn)粗提取液中的基質對目標分析物的響應值幾乎無影響。說明SPE純化濃縮目標分析物的同時基質也被濃縮,濃縮后的基質對目標物造成了基質抑制效應。由于基質抑制效應引起的靈敏度下降抵消了一部分由濃縮所提高的靈敏度,試驗中只要滿足SPE的濃縮倍數(shù)超過2即有利于提高整個方法的靈敏度。本試驗中SPE的濃縮倍數(shù)是7.5(15ml→2ml),結合串聯(lián)質譜檢測,使方法檢出限達到0.013μg/kg~0.085μg/kg,遠遠低于歐盟限值。2.4方法學參數(shù)2.4.1線性范圍和定量限在優(yōu)化的前處理和HPLC/MS/MS條件下,對本法配制的基質匹配標準曲線進行測定,以各分析物的定量離子的峰面積y對其在溶液中的濃度x(ng/ml)進行線性擬合,得到PTX2和AZA2在基質溶液中的線性方程、相關系數(shù)和線性范圍。采用在空白基質添加目標組分的方法,依據(jù)色譜峰的信噪比(S/N)等于3確定檢出限(LOD),S/N等于10確定定量限(LOQ),數(shù)據(jù)見表2。兩種分析物在低濃度范圍內(nèi)線性關系良好,其基質匹配標準曲線的線性相關系數(shù)達到0.999;PTX2和AZA2的LOQ達到0.28ng/ml和0.043ng/ml。2.4.2標準曲線的制作依據(jù)歐盟非強制執(zhí)行法案2002/657/EC的要求,如果不具備標準參考物質作為方法驗證對象的條件,則需進行方法加標回收試驗。本方法采用不含待測物的扇貝作為空白樣品,分別加入3種不同濃度水平(低、中、高)的PTX2和AZA2混合標準溶液,放置過夜。次日按照以上SPE操作步驟進行樣品預處理,測得分析物的峰面積按照基質匹配標準曲線計算出它們相應濃度,此濃度與加入量比較,比值即為回收率,結果見表3。從表中不難看出,此方法在低中高不同添加水平上都具有理想的加標回收率。2.4.3方法的標準測定空白扇貝基質中加入PTX2(3.44ng/ml)、AZA2(0.512ng/ml),平行測定6次,得到PTX2、AZA2的日內(nèi)標準偏差分別為4.5%、6.7%;連續(xù)5d對此加標樣品進行測定,并平行測定3次,得到PTX2、AZA2的日間標準偏差分別為7.8%、9.5%。加標扇貝樣品平均分成6份,按照所建立的方法測定其中兩種貝類毒素的含量,得到方法的標準偏差,結果顯示兩種貝類毒素的RSD均<7%,說明此方法具有良好的重復性。2.5樣品的測定應用本研究所建立的方法對寧波象山港一帶市售的60份雙殼貝類,包括扇貝、貽貝及牡蠣樣品進行了分析。其中有兩份貽貝中檢出了AZA2,濃度為0.035μg/kg;一份牡蠣樣品中檢出了PTX2,其濃度為0.4μg/kg;所測定的20份扇貝中均未檢測到AZA2和PTX2?？傮w來看,AZ