高濃度臭氧對(duì)蒙古櫟葉片抗氧化能力的影響

高濃度臭氧對(duì)蒙古櫟葉片抗氧化能力的影響

近年來，近地表土壤中的氧氣濃度顯著增加，地表徑流中的o3濃度每年增長0.5%。一旦接觸到植物葉片，就會(huì)產(chǎn)生活性氧和過氧化氫，這會(huì)影響細(xì)胞和細(xì)胞。降低植物的光合率，改變植物光合產(chǎn)物的分配，并影響植物的次生代謝過程，如植物的共生代謝。次生代謝是植物體內(nèi)重要的生理過程,其產(chǎn)物作為生理代謝的物質(zhì)基礎(chǔ),在植物對(duì)物理、化學(xué)環(huán)境的響應(yīng)和反饋過程中起著重要作用,具有重要的生態(tài)學(xué)意義.酚類化合物是次生代謝的主要產(chǎn)物,包括總酚、單寧、類黃酮等.國外很多學(xué)者對(duì)高濃度O3條件下樹木酚類物質(zhì)含量的變化進(jìn)行了研究,但是結(jié)果并不一致,有的研究認(rèn)為高濃度O3可使樹木體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量增加,有的研究則認(rèn)為高濃度O3對(duì)樹木體內(nèi)酚類物質(zhì)含量沒有影響.蒙古櫟(Quercusmongolica)為殼斗科櫟屬,是東北次生落葉闊葉林的主要組成樹種和我國主要用材樹種,也是沈陽城市森林中的重要樹種.本文采用開頂箱氣室(open-topchamber,OTC)進(jìn)行模擬,研究高濃度O3處理后蒙古櫟葉片次生代謝物質(zhì)含量的變化,并使用1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)法對(duì)蒙古櫟抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定.旨在探討高濃度O3條件下蒙古櫟葉片次生代謝的變化,為林業(yè)管理和城市綠化等部門制定相關(guān)政策提供理論依據(jù).1材料和方法1.1蒙古櫟人工林自然生態(tài)試驗(yàn)oct設(shè)計(jì)試驗(yàn)區(qū)位于沈陽市中心的南運(yùn)河中段的中國科學(xué)院沈陽樹木園(41°46′N,123°26′E),海拔高度41m,占地面積5hm2.該地區(qū)屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)型大陸性氣候區(qū),年平均氣溫7.41℃,極端最高氣溫38.31℃,極端最低氣溫-30.51℃,年平均降水量755.4mm.植物區(qū)系隸屬于長白植物區(qū)系、華北植物區(qū)和蒙古植物區(qū)系交匯處.本研究采用開頂箱(OTC)法.試驗(yàn)設(shè)施主要為開頂箱(直徑4m、高3m)及與其配套的通氣、通風(fēng)設(shè)備.包括:臭氧發(fā)生器(GP-5J,國產(chǎn))、臭氧傳感器(S-900,新西蘭)、溫濕度傳感器,以及數(shù)據(jù)分析與自動(dòng)控制充氣系統(tǒng).在整個(gè)試驗(yàn)期間,氣室內(nèi)實(shí)際O3濃度(EO)控制在(80±8)nmol·mol-1,為對(duì)照(CK)(自然O3濃度,約40nmol·mol-1)的2倍.2008年6月13日開始通氣,O3熏蒸時(shí)間為每天8:00—16:00,2008年6月28日取樣分析,共處理15d.選取5年生蒙古櫟為試驗(yàn)對(duì)象,每個(gè)箱內(nèi)7株植株,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),共6個(gè)開頂箱.整個(gè)處理期間,各箱內(nèi)管理方法相同,定期澆水施肥,防止干旱及貧瘠發(fā)生,條件控制一致.1.2總酚、總酚的制備取樣時(shí)間在9:00左右(O3熏蒸15d),選取蒙古櫟一年生成熟葉片,采集后分成鮮樣及干樣兩部分:鮮樣用打孔器打孔并稱取0.2g置于液氮保存;鮮樣用于測(cè)定丙二醛(MDA)含量,采用硫代巴比妥酸(TBA)法;另一部分置于室溫下通風(fēng)陰干(約25℃)粉碎,過40目篩,準(zhǔn)確稱取0.2g樣品,用甲醇(液料比40∶1)于40℃超聲波振蕩浸提1h,浸提后5600×g離心,上清液備用.總酚采用Folin-ciocalteu法(F-C法)測(cè)定,并以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品(天津化學(xué)試劑廠)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;類黃酮采用三氯化鋁顯色法測(cè)定,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,美國);縮合單寧采用鹽酸-香草醛法測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)品使用兒茶素(Sigma,美國).總酚、類黃酮、縮合單寧含量以標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、蘆丁、兒茶素的相對(duì)含量表示.1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,購于美國Sigma公司.DPPH法是一種快速、簡便的評(píng)價(jià)外源抗氧化劑和植物抗氧化能力的方法.本研究通過檢測(cè)蒙古櫟的葉提物對(duì)DPPH自由基的清除能力,檢測(cè)蒙古櫟葉抗氧化能力的變化.蒙古櫟葉片提取物對(duì)DPPH的清除能力以每克干物質(zhì)量樣品可以清除的DPPH毫克數(shù)表示.使用甲醇提取液測(cè)定蒙古櫟葉片總酚、類黃酮和縮合單寧含量以及DPPH自由基清除能力,每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次.1.3處理數(shù)據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2003進(jìn)行計(jì)算,使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析.2結(jié)果與分析2.1蒙古櫟葉片的a含量由表1可以看出,高濃度O3熏蒸處理的蒙古櫟葉片中MDA含量與對(duì)照差異不顯著,表明高濃度O3沒有使蒙古櫟葉片受到氧化傷害;高濃度O3處理后蒙古櫟葉片總抗氧化能力上升了91.25%,變化達(dá)到顯著水平(P=0.001).2.2縮合單晶含量高濃度O3處理的蒙古櫟葉片中總酚、類黃酮和縮合單寧含量分別比對(duì)照提高了48.17%、24.66%和26.77%(圖1),且總酚和單寧含量達(dá)到顯著水平(P<0.05).2.3蒙古櫟葉片醇提物對(duì)dpph的清除作用以蒙古櫟葉片醇提物對(duì)DPPH清除能力表示蒙古櫟總的抗氧化能力,并將對(duì)照與處理的蒙古櫟葉片醇提物對(duì)DPPH清除能力與對(duì)應(yīng)的總酚、類黃酮、縮合單寧含量做Pearson相關(guān)分析,結(jié)果顯示:蒙古櫟葉片醇提物對(duì)DPPH清除能力與葉片中總酚和縮合單寧的含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系,而且縮合單寧比總酚具有更好的相關(guān)性;類黃酮含量與葉片醇提物對(duì)DPPH清除能力相關(guān)不顯著(P>0.05)(表2).這表明總酚和縮合單寧與蒙古櫟的抗氧化能力顯著相關(guān),而與類黃酮不相關(guān).3對(duì)蒙古櫟葉片抗氧化能力的影響高濃度O3會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生脅迫.O3進(jìn)入植物細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生活性氧產(chǎn)物,對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,影響其正常的生理功能,甚至引起細(xì)胞死亡.酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)主要的次生代謝物質(zhì),也是植物體內(nèi)重要的防御物質(zhì).酚類物質(zhì)的酚羥基容易被氧化,因此通過還原反應(yīng)可以降低環(huán)境中的氧含量.Yamaji等研究表明,高濃度O3使樺樹葉片合成大量酚類物質(zhì),與本研究結(jié)果相一致;單寧作為氫供體可以釋放出氫與環(huán)境中的自由基結(jié)合,中止自由基引發(fā)的鏈鎖反應(yīng),從而阻止氧化過程的繼續(xù)傳遞和進(jìn)行,因此其具有很強(qiáng)的清除自由基的能力.但是Peltonen等的結(jié)果表明,高濃度O3雖顯著增加了樺樹葉片中單寧等酚類物質(zhì)含量,但是單寧與樺樹抗氧化能力無關(guān);Lindroth等認(rèn)為,高濃度O3對(duì)樺樹葉片中單寧含量沒有顯著影響.而本研究結(jié)果中,高濃度O3顯著增加了蒙古櫟葉片中單寧含量,且單寧的含量與蒙古櫟抗氧化能力顯著相關(guān),說明O3可能通過促進(jìn)酚類物質(zhì)的合成來增強(qiáng)蒙古櫟葉的抗氧化能力.類黃酮是一種有較強(qiáng)的抗氧化能力的次生代謝物.Saleem等研究表明,高濃度O3顯著增加了樺樹中黃酮等酚類物質(zhì)含量,但本研究中O3并沒有使類黃酮含量明顯增加,可能是因?yàn)楹铣深慄S酮比合成其他酚類物質(zhì)需要消耗更多的光合產(chǎn)物和能量,而最佳防御假說(optimumdefense,OD)認(rèn)為,植物次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生是以減少植物生長為成本的,只有在次生代謝物質(zhì)所能獲得的防御收益大于植物生長獲得的收益時(shí),植物才產(chǎn)生次生代謝物質(zhì),因此,蒙古櫟可能有選擇地去合成其他低成本的抗氧化物質(zhì)如單寧等來抵御O3脅迫.DPPH自由基的清除能力可以反映植物的抗氧化能力.O3處理后,蒙古櫟葉提取物對(duì)DPPH自由基清除能力提高,而且DPPH清除能力與總酚和單寧的含量顯著相關(guān),從而證實(shí)了蒙古櫟葉片中的總酚和單寧在響應(yīng)高濃度O3脅迫中起到重要作用,其含量的增加有助于提高蒙古櫟葉片的抗氧化能力.MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一,具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞中的許多分子如蛋白質(zhì)、核酸和酶等有破壞作用,其含量的增加可作為細(xì)胞膜受破壞的標(biāo)志之一.本研究中,高濃度O3并沒有引起蒙古櫟葉片MDA的變化,表明蒙古