精子冷凍貯存

精子冷凍貯存6.1引言精子冷凍保存是男科實(shí)驗(yàn)室工作中的一個(gè)重要組成部分，特別對(duì)不孕不育門(mén)診的男科實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)。從19世紀(jì)40年代末起，人類(lèi)就開(kāi)始研究精子低溫生物學(xué)。發(fā)現(xiàn)甘油能保護(hù)精子免受冷凍損傷，可以將人類(lèi)精子冷藏在-79°C的干冰上(Polgeetal.,1949;Bunge&herman,1953;Bungeetal.,1954)。隨著液氮廣泛應(yīng)用，人類(lèi)精子冷凍貯存技術(shù)取得快速發(fā)展，在許多國(guó)家建立起商業(yè)用途的精子庫(kù)和國(guó)際間合作服務(wù)項(xiàng)目(Perloffetal.,1964;Davidetal.,1980;Clarkeetal.,1997;Leiboetal.,2002)。由于采用不同的冷凍保護(hù)劑和不同冷凍程序，出現(xiàn)許多冷凍貯存實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。凍融后細(xì)胞存活率主要取決于細(xì)胞內(nèi)冰晶形成量能降低至何種程度，通過(guò)選擇恰當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑和采用最適冷凍速率和復(fù)融速率來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)水形成冰晶提高細(xì)胞的存活率(Sherman,1990;Keel&Webster,1993;Watson,1995)。特別在復(fù)融過(guò)程中，當(dāng)精子處于-130C(玻璃化轉(zhuǎn)化狀態(tài)的關(guān)鍵溫度)以上時(shí)間太長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)有害的冰晶增多發(fā)生重結(jié)晶。人類(lèi)精子能夠耐受一定范圍內(nèi)的冷凍和復(fù)融率。它們對(duì)快速冷凍(冷體克)產(chǎn)生損傷不敏感，主要原因可能是精子細(xì)胞膜中脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸增加細(xì)胞膜流動(dòng)性。而且因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)水分含量少(約為50%)，精子比其它細(xì)胞更能耐受低溫導(dǎo)致?lián)p傷。但是低溫仍對(duì)精子功能仍產(chǎn)生不良影響，特別是對(duì)精子活力影響比較大。一般而言，只有大約50%的活動(dòng)精子能在凍存后復(fù)蘇保持活力(Keel&Webster,1993)。優(yōu)化精子冷凍保存方法減低對(duì)活動(dòng)精子的損害從而提高妊娠率(Woodsetal.,2004)。影響供精人工授精的妊娠率的因素包括復(fù)融后精子質(zhì)量、人工授精的時(shí)機(jī)，而最為關(guān)鍵的是受方因素如年齡，前次供精妊娠情況以及與排卵、子宮輸卵管相關(guān)疾病(LeLannou&Lansac,1993)。如果精子保存方法合適，精子質(zhì)量不會(huì)隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。冷凍保存超過(guò)28年的精子仍能使婦女受孕分娩嬰兒(Clarkeetal.,2006;Feldschuhetal.,2005)。精子冷凍可適用于很多情況(見(jiàn)表6.1)，在某些特殊情況下，凍存過(guò)程需要進(jìn)行一些更改(見(jiàn)章節(jié)6.2.2)?？?.1精子冷凍保存的適應(yīng)癥供精供精是對(duì)具有生育能力的供精者精液進(jìn)行冷凍保存以便將來(lái)使用供。精者可由精子庫(kù)或診所進(jìn)行招募，他們精子可以匿名使用。在某些替代的情況，受者也可了解供者的基本情況。供精可以用于I、IUI、IVF、或荀CSI。沒(méi)有活精子或者不適合SI使用長(zhǎng)頭精子不育男性患者的伴侶，或冶療失敗，冶療費(fèi)用太高。能傳給下一代的遺傳疾病。血型不符導(dǎo)致嬰兒溶血性貧血。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，供精能提供成功妊娠。想懷孕的單身育齡女性。供精受孕需要嚴(yán)格遵守當(dāng)?shù)睾蛧?guó)家關(guān)于遺傳和傳染病篩查的法律法規(guī)。生育力保護(hù)男性在進(jìn)行有可能影響生育能力的活動(dòng)之前，可以通過(guò)精液冷凍保存生殖能力。具體如下：輸精管切除（考慮到將來(lái)存在婚姻狀態(tài)改變可能性或想再要一個(gè)孩子）。接受有可能永久損害生精功能的細(xì)胞毒性藥物或者放射治療。從事危險(xiǎn)職業(yè)的工作如軍隊(duì)，在允許遺腹子出生的國(guó)家。不孕癥治療在以下情況下，可以進(jìn)行精子冷凍以備H、IUI、IVF、或者ICSI治療：嚴(yán)重少精子癥或者精液中活動(dòng)精子間斷出現(xiàn)。不育癥的治療效果不能持久，如生殖管道堵塞手術(shù)再通或者是下丘腦垂體性腺發(fā)育不良的促性腺激素治療。通過(guò)輔助方法收集到的精液，如脊髓受損的病人輔助射精，逆行射精病人尿液中收集精子，或者通過(guò)手術(shù)方式從生精管道中收集精子。在輔助生育治療過(guò)程在取卵日或者H日不能留取新鮮的精液。阻斷傳染性疾病的傳播經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV感染患者，沒(méi)有檢出病毒的精液可以冷凍保存，這些精子可用于IUI，IVF，或者ICSI，這樣就能夠避免妻子在受孕過(guò)程中受IV感染危險(xiǎn)。注1：在保存生育力或者不育癥治療中的精子冷凍，盡可能保存1夠0次或以上人工受精使用的精子量，這樣才能夠提高妊娠成功率。而異常精液IH而凍存多份精液并不見(jiàn)得很有用。注2：在ICSI過(guò)程中1個(gè)精子就足夠讓1個(gè)卵子受精，所有的活動(dòng)精子都值得凍存。注3：在進(jìn)行有可能造成不育的治療前，凍存精液有很大的心理意義，因?yàn)檫@樣能夠讓病人對(duì)未來(lái)充滿希望。病人在接受細(xì)胞毒性藥物治療或者放射治療的之前，應(yīng)該把精液凍起來(lái)，因?yàn)檫@些治療過(guò)程都對(duì)精子有害。所有需要進(jìn)行放化療的病人都應(yīng)盡可能的保存精子。人類(lèi)精子冷凍和貯存是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，實(shí)驗(yàn)室工作人員不僅需要有高度的責(zé)任感，而且需要對(duì)綜合風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估?？?.2凍存和貯存人類(lèi)精子的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在評(píng)估人類(lèi)精子冷凍和貯存過(guò)程中危險(xiǎn)因素時(shí)，應(yīng)該充分考慮下列內(nèi)容。材料1．為了保證冷凍的精子不會(huì)被偷盜或者受火災(zāi)損害需，實(shí)施關(guān)于容器、樣本、冷凍室的物理安全，同時(shí)也要保證液氮的供應(yīng)。2．選擇合適的器械。3．液氮存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。人員安全和保護(hù)措施1．個(gè)人防護(hù)用具。2．檢測(cè)液氮量不足的警報(bào)系統(tǒng)和低氧環(huán)境的警報(bào)系統(tǒng)。交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)為了減少貯存樣本間通過(guò)貯存容器交叉感染傳染性微生物Hv、乙肝、丙肝病毒），需考慮下列幾個(gè)方面：1．存儲(chǔ)器的類(lèi)型：小瓶或麥管和封口方法。2．存儲(chǔ)介質(zhì)：液氮或者液氮蒸汽。3．對(duì)高危險(xiǎn)的樣本（已知感染病毒或懷疑感染病毒樣本）使用的存儲(chǔ)方法和程序。冷凍樣本的安全：1．為了防止樣本全部丟失，把樣本分開(kāi)放在不同的地方。2．在每一個(gè)處理步驟中都進(jìn)行雙人核對(duì)。3．使用明顯的標(biāo)記和識(shí)別條碼。對(duì)存貯的樣品和材料進(jìn)行定期核查。注1：用液氮蒸汽取代液氮進(jìn)行樣本保存時(shí)能夠減少交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。然而，不同的樣本形態(tài)和位置可能引起溫度梯度在個(gè)別情況有可能達(dá)不到-00°C以下(Tomlinson,2005)。所以當(dāng)使用液氮蒸汽來(lái)保存樣本時(shí)，必須確保溫度低于-130°C,盡量避免溫度對(duì)細(xì)胞的損害。注2：液氮存儲(chǔ)中，使用隔熱樹(shù)脂玻璃制備的密封試管可以達(dá)到防泄露、防病毒、防細(xì)菌，并且可以在-96°C下不變形。6.2精液冷凍方法有很多方法都可以進(jìn)行精子冷凍，下邊將列出具體的常用冷凍保護(hù)劑和冷凍過(guò)程中的機(jī)器控制。6.2.1標(biāo)準(zhǔn)步驟6?2?1?1制備冷凍保護(hù)劑GEYC1.在65ml的無(wú)菌蒸餾水中加入1.5g葡萄糖和1.3二水三羧酸檸檬酸鈉?；烊?5ml的甘油。加入1.3g的甘氨酸，等完全溶解后用0.45-pm的細(xì)孔過(guò)濾器過(guò)濾。加入20ml的新鮮蛋黃(從特制的無(wú)菌蛋中提取)：洗凈雞蛋把蛋殼剝?nèi)?，用注射器穿刺雞蛋膜取到蛋黃，一般一個(gè)雞蛋取10ml的蛋黃。在56C水浴箱中孵育40分鐘，并且要時(shí)不時(shí)攪拌一下。檢測(cè)溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之間范圍，這樣的溶液是不理想的，應(yīng)該丟棄重新制備，因?yàn)榭赡芗渝e(cuò)試劑或試劑量。在此階段，細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)。在此階段，也可以進(jìn)行精子毒性試驗(yàn)檢測(cè)。把溶液分裝到2ml的試管中，并且保存于-70C下。在3個(gè)月內(nèi)用完。同GEYC相似的冷凍保護(hù)劑已經(jīng)有商品供應(yīng)。6.2.1.2在精液標(biāo)本中增加冷凍保護(hù)劑復(fù)蘇冷凍保護(hù)劑，升溫至室溫并且混合，升溫到37°C的效果最好。2．在精液中添加冷凍保護(hù)劑需要很小心，因?yàn)楦邼舛鹊母视蜁?huì)對(duì)精子有害。3．可以一邊滴一邊旋轉(zhuǎn)，也可以用吸管上下混勻，或者逐漸加入5滴后在室溫下攪拌5分鐘，最終GEYC與精液的比例是1：2。4.加完GEYC后，需要在30-35°C的溫箱里孵化5分鐘。分裝精液到試管中傳熱性能好而且便于保存的0.5ml塑料試管比較常用。塑料小瓶適合存儲(chǔ)量比較多的樣本。把精液-GEYC混合液放入精液管或者冷凍管中。應(yīng)該應(yīng)用真空裝備或者適配器進(jìn)行分裝。密封麥管在棉花和羊毛之間有若干聚乙烯乙醇粉末塞子的試管能夠在精液裝滿時(shí)自動(dòng)聚合粉末。輕拍試管的一側(cè)讓試管底層有1cm的空氣。通過(guò)沾濕無(wú)菌聚乙烯酒精密封粉末對(duì)試管進(jìn)行密封，并且放置在1cm的水中。因?yàn)槊芊夥勰┛赡軙?huì)被某些病菌感染，所以加熱密封法似乎比較受歡迎。此外，可以把樣本存儲(chǔ)在塑料管或者安培中，常常不會(huì)超多90%的體積。把試管外面的水擦干，然后用70%的酒精或者其它清潔劑。應(yīng)用程序冷凍儀冷凍精子程序冷凍儀控制流進(jìn)冷凍室的液氮蒸汽量來(lái)冷凍精子。把麥管或者冷凍管放到程序冷凍儀中，并按照操用說(shuō)明激活程序。最常用的程序是按照每分鐘1.5C的速率從20C降到-6C，然后以每分鐘6C的速度降到-100C,整個(gè)過(guò)程大概需要40分鐘。在轉(zhuǎn)到液氮之前，需要在-100C下放置30分鐘。不同實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)有可能會(huì)使用更復(fù)雜的方法（PQrez-Sdnchezetal.,1994）。6.2.1.6手工冷凍法手工冷凍法不像程序冷凍儀易于控制，但也能得到良好的結(jié)果。在這個(gè)過(guò)程中有很多方法可以選擇。麥管應(yīng)先在-20°C的冰箱中放置30分鐘，然后在-79°C的干冰中放30分鐘。最后放入-196C的液氮。2?麥管從-20C冰箱移入另一個(gè)-70°C冰箱，或移入-80C至-100C的小容器頸部的液氮蒸氣和空氣的混合氣體內(nèi)籃子放置10-15分鐘后投入液氮中，也可以通過(guò)放置在大容器的液氮上方10-20cm懸掛支架，放置1小時(shí)形成溫度梯度層。冷凍精液貯存把冷凍麥管放入塑料存儲(chǔ)管內(nèi)，并插入更大的存儲(chǔ)筒里。把冷凍管用夾子加到固定的存儲(chǔ)罐中，這個(gè)方法使用于在氣體中，因?yàn)槔鋬龉軟](méi)有非常密封。在液氮中保存這些冷凍小管。冷凍精液運(yùn)輸目前市場(chǎng)上已經(jīng)存在用于轉(zhuǎn)運(yùn)冷凍精子的商用托運(yùn)罐，這些托運(yùn)罐通過(guò)液氮汽化可以讓保持低溫幾天到幾個(gè)星期不等。注：在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中需要嚴(yán)格遵循當(dāng)?shù)氐?、?guó)家的、以及國(guó)際上關(guān)于液氮和人類(lèi)生物樣本的轉(zhuǎn)運(yùn)條例。冷凍精子復(fù)蘇在使用前，從液氮或者氮?dú)夤拗心贸鲂枰玫脑嚬苋缓蠓旁诒〖埢蛘咴嚬芗苌?，這樣在6分鐘內(nèi)就可以達(dá)到室溫。而冷凍管需要花比較多時(shí)間。在10分鐘內(nèi)，用無(wú)菌剪刀把麥管尾部去掉，并放入受精管中備用，或者檢測(cè)復(fù)蘇后精子活動(dòng)率。如果是用快凍法進(jìn)行冷凍則復(fù)蘇時(shí)用快復(fù)蘇法(Verheyenetal.,1993)。應(yīng)用小劑量多步驟稀釋法把冷凍保護(hù)劑除開(kāi)，這樣能夠避免不恰當(dāng)滲透壓并且能夠提高妊娠率。6.2.2嚴(yán)重少弱精子癥和手術(shù)取到精子的冷凍方法1.只有很少的活動(dòng)精子的精液以及從生殖道中取到的精子懸液可以?xún)龃嫫饋?lái)用于ICSI。如果有必要，可以把精液在1500g的離心力下離心10分鐘，制成最小0.4ml,按照上文所述添加GEYC。附睪穿刺液、睪丸提取物或經(jīng)過(guò)上游法或者密度梯度法形成其它精子懸液，用含人血清白蛋白的精子培養(yǎng)液（HEPES緩沖體系）重懸，這樣重懸后的精子液就可以加入TGG冷凍保護(hù)劑，或者含有人血清白蛋白的冷凍保護(hù)劑。6.2.2.1TGG在40ml的無(wú)菌臺(tái)氏溶液（見(jiàn)附錄4、章節(jié)4.9）中加入5ml濃度為100mg/ml的人白蛋白，0.9g葡萄糖和5ml甘油。然后使用0.45-pm的細(xì)孔過(guò)濾器過(guò)濾溶液。分裝成2ml每份在-70°C下保存。6.2.2.2步驟1.如果樣本多于2ml，或者只有很少量精子那么應(yīng)該在室溫下在1500g離心力下離心5分鐘。吸掉上清液僅留1ml，重新懸浮精子后測(cè)定活動(dòng)精子的百分比，如果非常少量活動(dòng)精子出現(xiàn)在樣本中壓片計(jì)數(shù)活精子數(shù)。3?復(fù)融2mlTGG。1:1等體積往精子制備液中加入TGG,并混勻。包裝在麥管或試管中像上文所說(shuō)的方法冷凍，如果麥管沒(méi)有裝滿，那么需要加蓋以免在冷凍時(shí)飄浮在液氮上。6.2.3麥管標(biāo)簽和記錄用完整的編碼系統(tǒng)來(lái)標(biāo)記麥管或試管是很重要的。用實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)表格和電腦數(shù)據(jù)庫(kù)中代碼來(lái)保證供精者匿名情況。關(guān)健是每個(gè)供精者都有一個(gè)獨(dú)自的和安全的代碼?，F(xiàn)有很多潛在的代碼系統(tǒng)，最基本的要求是保證每個(gè)供者或凍精客人都有自己獨(dú)有的代碼。以下的代碼系統(tǒng)基本可以滿足臨床要求。每個(gè)匿名的供精者分配兩個(gè)字母代碼如（AA,AB,AC...BA…等，直到ZZ結(jié)束，其后使用新的方法）。3個(gè)字母代碼用于已經(jīng)名字的凍精者和供者如AAA,AAB...。供精者每次捐贈(zèng)的精液則用跟在個(gè)人代碼后面的數(shù)字來(lái)表示。