實(shí)驗(yàn)二 血涂片的制備和瑞氏染色課件

實(shí)驗(yàn)二、血涂片的制備和瑞氏染色及血細(xì)胞記數(shù)實(shí)驗(yàn)二、血涂片的制備和瑞氏染色及血細(xì)胞記數(shù)1

血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極廣泛，特別是對于各血液病的診斷具有重要的價(jià)值。血涂片制備是血液學(xué)檢查的重要基本技術(shù)之一。一張良好的血片，厚薄要適宜，頭體尾要明顯，細(xì)胞分布要均勻，膜的邊緣要整齊，并留有一定的空隙。血涂片制備時(shí)手工推片法用血量少、操作簡單，是最廣泛應(yīng)用的方法。血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極廣2實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)涂片制備的一般方法學(xué)習(xí)瑞氏染色的方法學(xué)習(xí)辨認(rèn)各種血細(xì)胞學(xué)習(xí)血細(xì)胞級數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)涂片制備的一般方法3實(shí)驗(yàn)原理用推片法將血液制成薄的血涂片，使血細(xì)胞成單層排列。瑞氏染料是由堿性染料美藍(lán)（Methvlemblue）和酸性染料伊紅（EostmY）合稱伊紅美藍(lán)染料即瑞氏（美藍(lán)－伊紅Y）染料。甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。實(shí)驗(yàn)原理用推片法將血液制成薄的血涂片，使血細(xì)胞成單層排列。4細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩。例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成5瑞氏染液中美藍(lán)如放置過久即可氧化而含有天青，美藍(lán)天青與伊紅化合物能使核染成紫紅色，染色主要是化學(xué)作用，是離子彼此結(jié)合的反應(yīng)。甲醇具有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定在一定形態(tài)及增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表面積，提高細(xì)胞對染料吸收作用，同時(shí)由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應(yīng)。瑞氏染液中美藍(lán)如放置過久即可氧化而含有天青，美藍(lán)天青與伊紅化6實(shí)驗(yàn)材料1、材料：蛙血和羊血2、瑞氏染液3、普通顯微鏡、玻片實(shí)驗(yàn)材料1、材料：蛙血和羊血7實(shí)驗(yàn)操作1、清潔載玻片：2、加樣：在干凈的載玻片右面1／3處滴血一滴。取另一張載玻片作為推片，讓推片的一端與血滴接觸，并與血滴玻片成35～45夾角。3、推片：待血液沿著兩塊載玻片接觸線向兩邊擴(kuò)散后，將推片保持夾角，向血玻片左側(cè)均速推進(jìn)，血液隨推片而行，在血玻片上形成一層血膜，即為血涂片。圖1-6推片流程：清潔－加樣－推片－干片－選區(qū)－染色－洗片實(shí)驗(yàn)操作1、清潔載玻片：圖1-6推片流程：84、干片：推好的血涂片在空氣中晃動，使其迅速干燥。5、選區(qū)：在顯微鏡下觀察，尋找涂片中均勻分散良好的血膜，用蠟筆在四周畫線，作為堤壩。6、染色：滴加適量的瑞氏染液覆蓋選定區(qū)域，染1分鐘；在滴加稍多的PH6.4的PBS緩沖液稀釋染液，輕搖混勻，液面浮現(xiàn)一層金黃色金屬物質(zhì)，然后靜置染色5－10min。7、洗去多余染液：用流水或滴加蒸餾水直接洗去浮液。8、觀察辨認(rèn)各種細(xì)胞。4、干片：推好的血涂片在空氣中晃動，使其迅速干燥。9區(qū)分：紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等區(qū)分：紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞10注意事項(xiàng)血量不能多，標(biāo)本過厚，細(xì)胞重疊不便觀察，并且造成細(xì)胞皺縮變形。染液PH值是6.4-6.8，染色偏酸或偏堿都會使染色反應(yīng)異常。PH對細(xì)胞染色有影響。由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下在正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用片必須清潔，無酸堿污染。配制頊特液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。注意事項(xiàng)血量不能多，標(biāo)本過厚，細(xì)胞重疊不便觀察，并且造成細(xì)胞11二、血細(xì)胞記數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法，一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。分兩步：1、制備細(xì)胞懸液2、計(jì)數(shù)與計(jì)算目的:學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的基本方法及誤差消除方法。二、血細(xì)胞記數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方12血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。

每一個(gè)大方格邊長為1㎜，則每一大方格的面積為1㎜2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1㎜，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1㎜3。血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺13使用步驟：1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。3、鏡下觀察。

使用步驟：14用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。1）一般計(jì)數(shù)四周大方格內(nèi)細(xì)胞，密度計(jì)算公式為：細(xì)胞密度（個(gè)/ml）＝(4大方格細(xì)胞總數(shù)/4)×10000×稀釋倍數(shù)2）記數(shù)中間大方格內(nèi)細(xì)胞，公式為：細(xì)胞密度（個(gè)/ml）＝（5個(gè)中方格總數(shù)/5)×25×10000×稀釋倍數(shù)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。15注意事項(xiàng)：務(wù)必使分散成單個(gè)細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)前，充分混勻細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)板及蓋玻片應(yīng)徹底用酒精棉球擦洗干凈。注意方法：加樣時(shí)要先蓋好蓋玻片，再加樣品。用細(xì)口滴管將細(xì)胞懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓懸液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室。（或用10l的加樣槍緩慢從蓋玻片邊緣加樣