《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件

天然抗癌藥物——紫杉醇的生產(chǎn)專題2天然抗癌藥物——紫杉醇的生產(chǎn)專題2目錄1、紫杉醇簡(jiǎn)介2、紫杉醇的作用3、南方紅豆杉組織培養(yǎng)4、紫杉醇的產(chǎn)量5、小結(jié)目錄1、紫杉醇簡(jiǎn)介2、紫杉醇的作用3、南方紅豆杉組1、紫杉醇簡(jiǎn)介1963年美國(guó)化學(xué)家瓦尼（M.C.Wani）和沃爾（MonreE.Wall）首次從一種生長(zhǎng)在美國(guó)西部大森林中稱謂太平洋杉（PacificYew）樹(shù)皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物。在篩選實(shí)驗(yàn)中，Wani和Wall發(fā)現(xiàn)紫杉醇粗提物對(duì)離體培養(yǎng)的鼠腫瘤細(xì)胞有很高活性，并開(kāi)始分離這種活性成份。1、紫杉醇簡(jiǎn)介1963年美國(guó)化學(xué)家瓦尼（M.C.Wani）野生紅豆杉一般散生在海拔1500-3000m的深山密林中，紫杉醇是從紅豆杉樹(shù)皮中提取出來(lái)的，每生產(chǎn)1kg紫杉醇需紅豆杉樹(shù)皮30噸，而且必須以成年樹(shù)木為原料，因此，紫杉醇售價(jià)昂貴，國(guó)際市場(chǎng)上每公斤售價(jià)在40萬(wàn)美元以上，最高時(shí)曾達(dá)到2200萬(wàn)美元/公斤。

《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件紅豆杉紅豆杉《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件紫杉醇是從紅豆杉（又名紫杉）樹(shù)皮中分離的一種二萜類化合物，具有天然的抗癌功效，能有效治療卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、惡性黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也有一定作用，被認(rèn)為是人類同癌癥抗?fàn)幍淖钣欣淦鳎?992年被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)正式批準(zhǔn)為抗癌新藥。2、紫杉醇的作用紫杉醇是從紅豆杉（又名紫杉）樹(shù)皮中分離的一種二萜類化合物，具

目前，雖然關(guān)于紫杉醇的研究取得了很大的進(jìn)展，但仍沒(méi)有比較成型的可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)。問(wèn)題：提取紫杉醇的紅豆杉資源不足化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以用化學(xué)合成法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)法因周期太長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)真菌發(fā)酵法生產(chǎn)的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于植物細(xì)胞的產(chǎn)量

但是，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看,紫杉細(xì)胞培養(yǎng)才是解決紫杉醇供需矛盾的最佳途徑。因此,紫杉細(xì)胞培養(yǎng)的研究近年來(lái)十分活躍。目前，雖然關(guān)于紫杉醇的研究取得了很大的進(jìn)展，但仍沒(méi)有比較成3、南方紅豆杉組織培養(yǎng)（1）、南方紅豆杉外植體的預(yù)處理以當(dāng)年生的莖段為材料，用清水沖洗干凈，轉(zhuǎn)入70%酒精浸泡30s，用無(wú)菌水漂洗一次，再轉(zhuǎn)入0.2%的升汞中浸泡8min。再經(jīng)無(wú)菌水沖洗5次，每次1-2min，用無(wú)菌濾紙吸去水分。3、南方紅豆杉組織培養(yǎng)（1）、南方紅豆杉外植體的預(yù)處理（2）、愈傷組織的誘導(dǎo)將處理好的莖段切成1cm的小段，接種于附加了0.15mg/L的萘乙酸(NAA)、0.1mg/L的6-芐氨基嘌呤(6-BA)、0.25mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS培養(yǎng)基上，放入人工氣候箱，24℃下暗培養(yǎng)，相對(duì)濕度60%。（2）、愈傷組織的誘導(dǎo)《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)，必須有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的參與，且對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和配比有嚴(yán)格的要求，其中NAA和6-BA的濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)速度均有非常重要的影響，2，4-D也有一定的作用。紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)，必須有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的參與，且對(duì)植物（3）、愈傷組織的傳代培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上，愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，但是該培養(yǎng)基卻不適合紅豆杉愈傷組織的生長(zhǎng)，因此，我們選用B5培養(yǎng)基作為紅豆杉愈傷組織的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/外植體數(shù)（3）、愈傷組織的傳代培養(yǎng)挑選出質(zhì)地疏松、顏色淺綠或者白色的紅豆杉愈傷組織接種于附加了0.5mg/L的NAA、0.5mg/L的6-BA和1.0g/L的水解酪蛋白的B5培養(yǎng)基，24℃下黑暗培養(yǎng)，每35天繼代一次。挑選出質(zhì)地疏松、顏色淺綠或者白色的紅豆杉愈傷組織接種于附加了《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件紫杉醇是紅豆杉的一種次生代謝產(chǎn)物。水解酪蛋白作為誘導(dǎo)子加入培養(yǎng)基中，起著刺激植物細(xì)胞合成防御性次生代謝產(chǎn)物的作用。它可以通過(guò)改變次生代謝途徑中催化酶的酶活力，引起次生代謝途徑中代謝通量和反應(yīng)速率的改變，從而提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。紫杉醇是紅豆杉的一種次生代謝產(chǎn)物。水解酪蛋白作為誘導(dǎo)子加入培不用2,4-D作為生長(zhǎng)素的主要原因是，它對(duì)紅豆杉的次生代謝有抑制作用，影響紫杉醇的產(chǎn)量。而且2,4-D是一種潛在的致癌物質(zhì)，應(yīng)盡量減少其在植物細(xì)胞內(nèi)的積累。不用2,4-D作為生長(zhǎng)素的主要原因是，它對(duì)紅豆杉的次生代謝有（4）、愈傷組織的抗褐變褐變現(xiàn)象：植物組織在破損時(shí)會(huì)溢出一些酚類物質(zhì)，可被酶類或空氣中的氧氣催化氧化成有毒的醌類物質(zhì)，使得愈傷組織出現(xiàn)褐色乃至黑色，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這就是褐變現(xiàn)象。愈傷組織褐變程度可分5級(jí)：0級(jí)：外觀鮮艷，黃白色；1級(jí)：輕度褐變，基本上黃白色；2級(jí)；褐變，黃褐色；3級(jí)：較嚴(yán)重褐變，褐色；4級(jí)：嚴(yán)重褐變，黑褐色。（4）、愈傷組織的抗褐變褐變現(xiàn)象：植物組織在破損時(shí)會(huì)溢出一些褐變的機(jī)制：褐變包括酶促褐變和非酶促褐變。目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促引起的。酶促褐變必須具有酶、底物和氧3個(gè)條件。引起褐變的酶有多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等，但最主要的是PPO，它使植物組織細(xì)胞中含有的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色醌類，從而產(chǎn)生酶促褐變。褐變的機(jī)制：褐變包括酶促褐變和非酶促褐變。目前認(rèn)為植物組織培《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件褐變與材料的基因型和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分和激素配比等因素有關(guān)。要防止褐變發(fā)生，減輕褐變危害，除了要選擇合適的外植體、培養(yǎng)基和適宜的激素組合外，添加抗褐變劑是較為方便有效的常規(guī)手段。目前常用的抗褐變劑有EDTA、植酸（PA）、水解酪蛋白、硫代硫酸鈉、活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）等。褐變與材料的基因型和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分和激素配比等因素有關(guān)紅豆杉愈傷組織的褐變主要是在多酚氧化酶（PPO）的催化下發(fā)生的，PPO是一種含銅離子的酶，上述抗褐變劑中PA能夠絡(luò)合銅離子，水解酪蛋白可以與酶底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，而AC可以對(duì)酶進(jìn)行吸附。褐變的機(jī)制紅豆杉愈傷組織的褐變主要是在多酚氧化酶（PPO）的催化下發(fā)生4、紫杉醇的產(chǎn)量（1）、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品2.4mg溶于甲醇中定容至50mL，以甲醇為對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行全波段掃描以確定最大吸收峰。再將標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液稀釋成濃度梯度為48、24、12、6、3、1.5μg/mL的溶液，在其特征吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值，繪制紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的UV標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、紫杉醇的產(chǎn)量（1）、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（2）、紫杉醇的提取稱取2.0g傳至第三代的南方紅豆杉愈傷組織，經(jīng)蒸溜水洗去瓊脂后用濾紙吸去愈傷組織表面的水分。把愈傷組織置于研缽中，加入CH3COOC2H5/C2H5OH（V:V=1:1）20.0mL進(jìn)行勻漿。所得提取液3000r/min離心5min，收集上清液，常溫下減壓除去溶劑，所得浸膏加入10.0mL水，用氯仿10.0mL萃取浸膏，共3次，氯仿萃取液合并共約30.0mL。向其中加入6.0mL丙酮，再次常溫減壓蒸干，用甲醇10.0mL定容，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，并計(jì)算紫杉醇含量。（2）、紫杉醇的提取將南方紅豆杉樹(shù)皮樣品風(fēng)干后粉碎，40℃下烘干24h。稱取20.0g粉末，置于研缽中，加入CH3COOC2H5/C2H5OH（V:V=1:1）200.0mL，進(jìn)行勻漿。所得提取液3000r/min離心5min，收集上清液，常溫下減壓除去溶劑，所得浸膏加入100.0mL水，用氯仿100.0mL萃取浸膏，共3次，氯仿萃取液合并共約300.0mL。向其中加入60.0mL丙酮，再次常溫減壓蒸干，用甲醇100.0mL定容，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，并計(jì)算紫杉醇含量。將南方紅豆杉樹(shù)皮樣品風(fēng)干后粉碎，40℃下烘干24h。稱取20紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品在208nm和227nm處有特征吸收峰，本實(shí)驗(yàn)選擇227nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品在208nm和227nm處有特征吸收峰，本實(shí)驗(yàn)選《生物技術(shù)制藥》天然抗癌藥物-紫杉醇-專題課件樹(shù)皮和愈傷組織的提取物在227nm下吸光度A分別為0.8285和0.2379，代入回歸方程，可知其濃度分別為22μg/mL和5.41μg/mL，相應(yīng)的含量分別為0.011%和0.052%，通過(guò)組織培養(yǎng)紫杉醇的含量提高了4.73倍。樹(shù)皮和愈傷組織的提取物在227nm下吸光度A分別為0.8285、小結(jié)由于近年來(lái)對(duì)紫杉醇的研究十分活躍，紫杉醇的獲得方法也越來(lái)越多，紫杉醇的