球蟲試驗計劃

摘要：對南昌市場購買的成年雞腸道，采用飽和鹽水漂浮法檢查，同時從腸內(nèi)容物中獲取混合球蟲卵囊。在制備好的瓊脂薄層的載玻片上滴加稀釋適度的混合卵囊液。在顯微鏡下用手術(shù)刀片小心切割瓊脂薄層，達(dá)到瓊脂薄層上僅剩單一卵囊的嚴(yán)格要求。把單一卵囊包裹后經(jīng)口感染雛雞，又從感染雛雞糞便中收集大量球蟲卵囊待孢子化后再次重度感染雛雞，掌握該球蟲蟲株特征及感染雞的病理變化。結(jié)果表明：單卵囊感染雛雞，感染率為40%；經(jīng)增殖傳代球蟲卵囊感染雛雞蟲株，初步鑒定為雞堆型艾美耳球蟲（Eimeriaacevulina）。關(guān)鍵詞：堆型艾美耳球蟲；南昌株；分離；鑒定v1材料與方法1.1材料1.1.1混合球蟲卵囊。從南昌市場購買成年雞腸道內(nèi)容物獲取。1.1.2試驗動物。1日齡雄性雛雞20只（購自南昌青云譜區(qū)，熊坊鄉(xiāng)某孵化場）1.1.3試驗藥品。重銘酸鉀（AR級），食用鹽（江西鹽業(yè)集團(tuán)公司），瓊脂條。1.1.4試驗器械。生化培養(yǎng)箱，離心機(jī)，普通天平，內(nèi)光源生物顯微鏡，1000W雙聯(lián)電爐，數(shù)碼照相機(jī)，物測微尺和目測微尺，鋼鋁鍋，500mL搪瓷杯，60mL三角瓶，60目銅篩，260目尼綸篩，眼科鑷，膠頭吸管，250mL燒杯。1.2方法1.2.1飽和食鹽水與2.5%重銘酸鉀液的制備。以量筒量取清水1000mL至鋼鋁鍋內(nèi)，電爐加熱沸騰，倒入食鹽380g攪拌、溶解、冷卻、過濾即為飽和鹽水；以重銘酸鉀25g溶于1000mL清水中即為2.5%重銘酸鉀液。1.2.2混合球蟲卵囊檢查、收集培養(yǎng)。取腸內(nèi)容物于搪瓷缸內(nèi)，加少量飽和鹽水搗碎攪拌成糊狀，再加65mL飽和鹽水?dāng)噭颍?jīng)60目銅篩和260目尼綸篩過濾，濾液盛滿60mL的三角瓶內(nèi)并成凸形，靜置20min后載玻片觸及凸點(diǎn)迅速翻轉(zhuǎn)，在16X16倍顯微鏡下觀察尋找卵囊，發(fā)現(xiàn)大量卵囊后用膠頭吸管吸取上浮液于青霉素空瓶內(nèi)，兌加2.5%重銘酸鉀液3mL，置30°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h備用。1.2.3雛雞的飼養(yǎng)與管理。雄性雛雞飼養(yǎng)于殺滅卵囊的紙盒內(nèi)或大鼠籠內(nèi)，飼喂新鮮小雞料和潔凈清水，每次做到先洗手后飼喂雛雞，杜絕意外球蟲卵囊感染。1.2.4單卵囊分離。用天平秤取瓊脂條1g于250mL燒杯中，添加清水100mL，電爐加熱沸騰攪拌成透明狀，趁熱用膠頭吸管滴加膠凍液于載玻片上，待冷卻后再用膠頭吸管取已孢子化的混合球蟲卵囊于成型的瓊脂薄層上，置顯微鏡下逐行尋找球蟲卵囊，卵囊密度控制在每個視野約有5~7個，顯微鏡觀察下用手術(shù)刀片細(xì)心切割瓊脂薄層，使瓊脂薄層上僅留一個球蟲卵囊，確認(rèn)一個卵囊后將該小塊瓊脂轉(zhuǎn)移置較大瓊脂薄層上并包裹好。1.2.5單卵囊感染。在助手協(xié)同下打開雛雞喙，將包裹物經(jīng)口腔滴加少量清水確認(rèn)喂服。共感染10只7日齡雛雞，記錄感染時間，分籠飼養(yǎng)。1.2.6純種子代卵囊收集與感染。第4~8d開始每天用飽和鹽水漂浮法檢查雛雞新鮮糞便，當(dāng)檢查有球蟲卵囊時記錄雞只和排出卵囊時間并開始收集卵囊。取新鮮雛雞糞便于500mL搪瓷杯內(nèi)，杯內(nèi)裝有，杯內(nèi)裝有一定量的5°C清水。待收集一定量糞便后，將搪瓷杯內(nèi)原有的清水傾去并搗碎成糊狀，加350mL清水混勻，經(jīng)60目銅篩及260目尼綸篩過濾，濾液分裝8支離心管，每支45mL，以2000r/min離心5min；留沉淀物，取少許沉淀物與10mL飽和食鹽水?dāng)嚢琛嚢韬?支管歸裝于1支管。倒完沉淀物的7支離心管分別加10mL清水，以2000r/min離心5min，留含沉淀物離心管內(nèi)的上液棄沉渣，再兌加清水至45mL處，以2000r/min離心10min，棄上清液留沉淀溶液少許，這樣加清水重復(fù)離心洗凈，最后將富含卵囊沉淀液從離心管中用吸管吸出移入60mL三角瓶內(nèi)［7］，加等量5%重銘酸鉀液置30C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1.2.7純種孢子化卵囊感染。膠頭吸管吸取含大量卵囊液，經(jīng)口感染12日齡雛雞10只，7d后每天剖檢2只雛雞，觀察腸道表面病變情況并照相。1.2.8蟲株的鑒定。取少量已孢子化的球蟲卵囊液于載玻片上，在16X40倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)該球蟲卵囊有幾種形態(tài)，有無極粒、卵囊及孢子囊殘體、斯氏體等。用顯微測微尺測量卵囊大小及孢子囊大小，測量100個該卵囊，算出其卵囊大小的平均值及卵囊形狀指數(shù)，結(jié)合潛隱期及腸道表面病變部位，比對感染雛雞病理變化堆型艾美耳球蟲多在上表皮層發(fā)育，并且同一發(fā)育階段的蟲體聚集在一起；被損害的十二脂腸和小腸前段出現(xiàn)大量白色小斑點(diǎn)，引起腸道腫脹、出血。（2.4雛雞感染球蟲卵囊蟲株的鑒定采用1只感染成功的雛雞排出的卵囊，經(jīng)增殖傳代的球蟲卵囊感染雛雞蟲株，根據(jù)其特征，初步鑒定為雞堆型艾美耳球蟲（Eimeriaacevulina）。（見下表）表1雞堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacevulina)蟲株的鑒定雞堆型艾美耳球蟲卵囊特征3分析與討論3.1蟲株分離技術(shù)的意義雛雞感染球蟲在自然情況下多是混合感染，而以某一種占優(yōu)勢。由于不同的地理株在抗藥性和致病力之間都表現(xiàn)出不同的抗藥水平，所以為了研究的準(zhǔn)確性,往往應(yīng)用純種株進(jìn)行研究。球蟲的單卵囊分離技術(shù)不但能保證所獲得的卵囊為純種，還可以進(jìn)行球蟲種類的鑒別和球蟲純種體系的建立?？傊?，建立一個便捷可行的純種分離技術(shù)是對球蟲深入研究的前提和保證［6。3.2試驗體會在整個試驗過程中，必須進(jìn)行嚴(yán)格消毒，保證試驗所需的無毒環(huán)境;每次離心收集卵囊時，要反復(fù)離心，以洗凈鹽分避免損壞蟲體；離心后，應(yīng)將離心管內(nèi)液面逐層檢查，以免由于離心時間不夠或轉(zhuǎn)數(shù)不足致使蟲體未完全存在于某一液面層而造成卵囊的丟失；確認(rèn)瓊脂薄層上單卵囊時間不宜過長，否則因為瓊脂干燥而影響觀察球蟲卵囊，當(dāng)切割瓊脂薄層時一定要仔細(xì)小心；感染時，盡量在雛雞較餓時投服，避免由于其進(jìn)食過多而造成投喂困難；向雞口中滴入清水時要避免水從口中溢出，防止卵囊丟失。單卵囊感染后，雞糞中排出子代卵囊的時間往往要遲于最短潛隱期幾小時，在潛隱期之前清除糞便，一般在感染后前4d無須檢查糞便，以免浪費(fèi)試驗用品和耗費(fèi)不必要的時間和精力。3.3堆型艾美耳球蟲蟲株的初步鑒定試驗中單卵囊感染10只雛雞，受感染為4只。對其中1只受感染的雛雞中的球蟲卵囊，經(jīng)復(fù)制增殖分離純化獲得堆型艾美耳球蟲蟲株。其他3只雛雞感染的是什么類型球蟲蟲株還不得而知，如需掌握當(dāng)?shù)仉r雞患球蟲種類，試驗方法同樣要逐一獲得結(jié)果。窄卵圓形23.2X17.3-15.7X13.119.5X15.2無色1.28兩層、光滑無抱子卵及卵囊殘體有1極粒有斯氏體19?24h十二指腸及小腸前段卵囊形狀卵囊大小(|±m(xù)2)平均大小(|±m(xù)2)卵囊顏色形狀指數(shù)卵囊壁殘體極粒斯氏體完成孢子化時間潛隱期寄生部位球蟲單卵囊分離1.3.1蟲卵收集從長沙朗梨附近農(nóng)戶家采集病雞糞，取一部分雞糞漂浮鏡檢,可見有許多大小不一的球蟲卵囊。將雞糞裝入離心管中，加水離心2次(2000r/min,10min)，傾去上清液，再加飽和食鹽水離心(2000r/min,10min)1次,雞糞渣沉于管底,卵囊漂浮于飽和食鹽水表面。用經(jīng)火焰消毒的鐵絲環(huán)將漂浮于飽和食鹽水表面的球蟲卵囊打環(huán)入含25g/L重鉻酸鉀溶液的平皿中,保存于29°C的恒溫箱中2d?3d，得到混合種抱子化卵囊。1.3.2瓊脂糖薄板的制備將2g瓊脂倒入100mL小燒杯中，加水49mL,白糖1.5g,用水浴加熱法加熱到完全溶解即成40g/L瓊脂糖溶液。取40g/L的瓊脂糖溶液2mL均勻傾于干燥潔凈的載玻片上,4C冰箱放置30min后，另準(zhǔn)備一塊大玻璃板,涂少許甘油,將載玻片上已經(jīng)凝固的厚約1.5mm的瓊脂糖板轉(zhuǎn)移至大玻璃板上，于4C冰箱凍干,1d后即成瓊脂糖薄片,可用于單卵囊包被。臨用時再將大玻璃板上的瓊脂糖薄片轉(zhuǎn)移到干燥潔凈的載玻片上，便于顯微鏡下觀察。1.3.3球蟲單卵囊的分離用潔凈滴管吸取25g/L重鉻酸鉀培養(yǎng)的球蟲混合卵囊液，滴5滴于潔凈試管內(nèi),加生理鹽水稀釋至每滴只含1個?2個抱子化卵囊。滴1滴于干凈載玻片上，在低倍鏡下觀察，每個視野有1個?2個球蟲卵囊。在顯微鏡觀察下,直接吸取卵囊。其方法是:右手持自制玻璃毛細(xì)吸管的尖端正對視野中的一個卵囊，將吸管向卵囊直伸過去，將一個卵囊吸上來。把毛細(xì)吸管中的液體滴落到鋪有瓊脂糖薄片的載玻片上，在顯微鏡下觀察，確定只有一個蟲卵即可。用雙面刀片把載玻片上的只含一個球蟲卵囊的瓊脂糖薄片輕輕切割成約1.5cmX1.5cm的小方塊,將此瓊脂糖薄片直接將單個卵囊包埋起來，雞球蟲單卵囊分離即告成功。球種鑒別1.1兔糞的采集兔糞采集自九臺市九臺鎮(zhèn)郊及春陽等鄉(xiāng),各鄉(xiāng)按自然村落分散采集兔的新鮮糞便，主要以1~4月齡幼兔為主，不拘其種類，每只采集5~10g,共采集了兔糞68份,分別放入容器中，帶回實(shí)驗室以備檢驗。1.2培養(yǎng)方法用飽和鹽水將糞泡開混勻，用60孔/寸的銅篩過濾，取漂浮上清液，以1500r/min離心10min,取其沉淀放入小試管中，加入2.5%重鉻酸鉀溶液，深約0.5cm,27°C恒溫箱中培養(yǎng)。1.3種類鑒別培養(yǎng)12h后,做第一次檢查，以后每隔8~12h檢查1次，以確定子抱子形成最早時間,90h后停止培養(yǎng),用顯微鏡觀察其形態(tài)、顏色及內(nèi)殘體及用膜孔的有無,同時用測微尺，測量卵囊的大小，以鑒別其種類。致病性測定1.1實(shí)驗動物高原鼠兔捕自中國科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位站地區(qū)。2010年3月和6月分別活捕72只成體（雄體46只，體重為159.90土2.37g;雌體26只，體重為146.84土3.28g）和45只亞成體（雄體21只，體重為86.43土7.23g;雌體24只，體重為77.04土4.33g）。將高原鼠兔帶回實(shí)驗室后，單只飼養(yǎng)于飼養(yǎng)籠內(nèi)。該籠具為全不銹鋼水沖式兔籠（40cmX30cmX22cm），兔籠底層有一可抽取的活動托盤，可供收集糞便用。為準(zhǔn)確測定感染劑量對實(shí)驗個體的致死率，用于實(shí)驗的全部個體均為無球蟲感染個體。由于在不發(fā)生重復(fù)感染的情況下，球蟲感染為自限性，為此，在實(shí)驗前，每天沖洗飼養(yǎng)籠具，并在100C干烤1h。同時收集糞便，用常規(guī)飽和鹽水漂浮法檢查球蟲卵囊。若連續(xù)3d未從糞便中監(jiān)測到球蟲的個體，被認(rèn)為是無球蟲感染個體，備選用于實(shí)驗。在實(shí)驗前和實(shí)驗期間，給動物提供充足的兔顆粒飼料（北京實(shí)驗動物飼養(yǎng)中心生產(chǎn)）和飲水，并附加少量胡蘿卜。室溫和光周期均為自然環(huán)境的溫度和光照。1.2混合球蟲2009年6月在疑似球蟲病死亡的2只高原鼠兔的腸道內(nèi)容物中，用常規(guī)的飽和鹽水漂浮法分離出球蟲卵囊，加入2.5%的重鉻酸鉀溶液，置于27^土0.5°C的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至抱子化。之后，經(jīng)多次卵囊增殖，最后獲得E.cryptobarretti和E.klondikensis的混合球蟲卵囊（在混合卵囊中分別占69%和31%）。1.3實(shí)驗處理為測定球蟲對成體的致死率，將無球蟲感染的成體隨機(jī)分為6組，分別經(jīng)口感染6000X104個/mL（An=6，早n=2）、600X104個/mL（An=7，早n=5）、60X104個/mL（An=7，早n=5）、6X104個/mL（An=6，早n=5）和0.6x104個/mL（An=7，早n=3）艾美耳混合球蟲卵囊1mL。對照組以同樣的方法經(jīng)口灌注1mL水（An=9，早n=5）。在亞成體中，將無球蟲感染的實(shí)驗個體隨機(jī)分為4組，分別經(jīng)口感染600X104個/mL（An=5，早n=5）、60X104個/mL（An=5，早n=7）和6X104個/mL（An=5，早n=8）艾美耳混合球蟲卵囊1mL，對照組個體以同樣的方法經(jīng)口灌注1mL水（An=5，早n=3）。在實(shí)驗