實驗一分子熒光光譜法省名師優(yōu)質課獲獎課件市賽課一等獎課件

試驗序號試驗名稱總課時上課周次試驗課時和時間試驗室指導老師1熒光光譜4第6周3月26日（周一），13:30–17:003月28日（周三），13:30–17:00812曾力希2紫外－可見光譜4第6周3月31日（周六），13:30–17:00816曾力希3紅外光譜4第8周4月9日（周一），13:30–17:004月11日（周三），13:30–17:00816曾力希4旋光儀4第9周4月16日（周一），13:30–17:004月18日（周三），13:30–17:00816曾力希5氣相色譜4第10周4月23日（周一），13:30–17:004月25日（周三），13:30–17:00812曾力希6液相色譜4第11周4月30日（周一），13:30–17:005月2日（周三），13:30–17:00816曾力希7電泳儀原理與應用4第12周5月7日（周一），13:30–17:005月9日（周三），13:30–17:00106曾力希-年春季《色譜與光譜試驗》第1頁教師：曾力希Email:lxzeng@

電話：88256851

辦公室：教學樓206室

助教：蔡波太電話：88256141

辦公室：教學樓824室

第2頁lxzeng@從七個試驗中選取一個試驗，認真寫一個完整試驗匯報（包含試驗目標、試驗原理、試驗結果及相關結論等），紙質打印版遞交到206或824室，電子版發(fā)送至郵箱:需要課件同學能夠在學校課程網站下載第3頁試驗一分子熒光光譜法分子熒光分析法基本原理

介紹熒光光譜產生、主要影響原因、熒光強度與被測物質之間關系熒光分析儀器分子熒光定量分析第4頁1.概述一、分子發(fā)光分析法及其分類一些物質分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎上建立起來分析方法為分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量第5頁依據(jù)分子受激時所吸收能源及輻射光機理不一樣分為以下幾類：光致發(fā)光：以光源來激發(fā)而發(fā)光

電致發(fā)光：以電能來激發(fā)而發(fā)光—原子發(fā)射光譜法生物發(fā)光：以生物體釋放能量激發(fā)而發(fā)光化學發(fā)光：以化學反應能激發(fā)而發(fā)光—化學發(fā)光分析法熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法第6頁二、分子熒光分析法特點1.靈敏度高熒光強度隨激發(fā)光強度增強而增強（提升激發(fā)光強度，可提升熒光強度

采取高靈敏度檢測系統(tǒng)可大大提升靈敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低2~4個數(shù)量級激發(fā)發(fā)射熒光強強激發(fā)光物質第7頁2.選擇性好不一樣物質用不一樣光進行激發(fā)，選擇不一樣激發(fā)光波長不一樣物質發(fā)射熒光不一樣，選擇不一樣檢測熒光波長比較輕易排除其它物質干擾，選擇性好3.試驗方法簡單4.待測樣品用量少；儀器價格適中；測定范圍較廣具發(fā)光強度可定量測定許多痕量無機物和有機物，廣泛應用在生物化學、分子生物學、免疫學及農牧產品分析、環(huán)境分析等領域。熒光法比磷光法應用廣泛，不如分光光度法第8頁2.熒光光譜法一、熒光光譜產生含有不飽和基團基態(tài)分子光照后，價電子躍遷產生熒光基態(tài)分子價電子躍遷到激發(fā)態(tài)光照激發(fā)去激發(fā)光*

*n基態(tài)

在光致激發(fā)和去激發(fā)光過程中，分子中價電子（、n電子）處于不一樣自旋狀態(tài)，通慣用電子自旋狀態(tài)多重性來描述第9頁1.電子自旋狀態(tài)多重性大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，基態(tài)分子每一個軌道中兩個電子自旋方向總是相反

，處于基態(tài)單重態(tài)。用“S0”

表示；當物質受光照射時，基態(tài)分子吸收光能產生電子能級躍遷，由基態(tài)躍遷至更高單重態(tài)，電子自旋方向沒有改變，凈自旋=0.這種躍遷是符合光譜選律基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)單重態(tài)S1S0,S1,S2,S3分別代表基態(tài),第一,二,三激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)分子含有抗磁性，激發(fā)態(tài)平均壽命約為10-8第10頁若分子中電子躍遷過程中伴伴隨自旋方向改變，由基態(tài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋

0。這種躍遷為禁阻躍遷

T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)三重態(tài)T1自旋平行三重態(tài)分子含有順磁性，激發(fā)態(tài)平均壽命約為10-4~1S第11頁分子中電子受激躍遷到激發(fā)態(tài)后，處于激發(fā)態(tài)分子是不穩(wěn)定，去激返回到較低激發(fā)態(tài)或基態(tài)時有兩種方式：無輻射去激和輻射去激2.無輻射去激——不伴隨發(fā)光現(xiàn)象過程叫無輻射去激，體系內多出能量以熱形式釋放。包含：內部轉換（IC）—相同多重態(tài)之間轉換S-S系間竄躍（ISC）—不一樣多重態(tài)之間轉換S-T振動馳豫（VR）—同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級過程外部轉移—指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質分子相互作用及能量轉移，使熒光或磷光強度減弱或毀滅發(fā)生系間竄躍電子需轉向，S1—T1間進行，比內部轉換困難第12頁T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振動馳豫IC：內部轉換ISC：系間竄躍第13頁3.熒光光譜產生—輻射去激處于S1或T1態(tài)電子返回S0態(tài)時，伴隨有發(fā)光現(xiàn)象，這種過程叫輻射去激

S1或T1S0

發(fā)光（1）熒光：當電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1最低振動能級回到基態(tài)S0各振動能級所產生光輻射叫熒光熒光是相同多重態(tài)間允許躍遷，產生速度快，10-9~10-6s，又叫快速熒光或瞬時熒光，外部光源停頓照射，熒光馬上熄滅不論開始電子被激發(fā)至什么高能級，它都經過無輻射去激消耗能量后到S1最低振動能級，發(fā)射熒光，熒光波長比激發(fā)光波長長。

熒>

激第14頁T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光圖5-1分子熒光光譜產生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫IC：內部轉換ISC：系間竄躍第15頁二、熒光與分子結構關系了解熒光與分子結構關系，能夠預測哪些物質能產生熒光，在什么條件下產生，以及發(fā)射熒光有什么特征方便更加好地利用熒光分析技術，采取一些辦法把不發(fā)熒光物質產生熒光，即把非熒光體變成熒光體，弱熒光體變成強熒光體（一）熒光效率熒光強度慣用熒光量子效率φf來描述

熒光量子效率

f=發(fā)熒光分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)

f

是一個物質熒光特征主要參數(shù)，反應了熒光物質發(fā)射熒光能力，f

越大，熒光越強，在0~1之間第16頁普通情況，有機芳香族化合物及金屬離子配合物是最強最有用熒光體（二）熒光與有機化合物結構關系物質只有吸收了紫外可見光，產生*，n*躍遷，產生熒光*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102~103，壽命短*躍遷常產生較強熒光，n*躍遷產生熒光弱第17頁1.共軛體系——有較強熒光含有共軛體系芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產生熒光波長越長，發(fā)射熒光強度越強

f

ex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結構比非線狀結構熒光波長長第18頁

芳香族化合物因含有共軛不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是主要環(huán)境污染物，可用熒光法測定

3，4-苯并芘是強致癌物

ex=386nm

em=430nm第19頁2.剛性平面結構—較穩(wěn)定平面結構含有強熒光分子多數(shù)有剛性平面結構熒光素：氧橋把兩個環(huán)固定在一個平面上，含有平面結構，強熒光物質酚酞：無氧橋把兩個環(huán)固定，不能很好共平面，為非熒光物質第20頁例1，2-二苯乙烯反式：平面構型強熒光體順式：非平面構型非熒光體第21頁（三）金屬螯合物熒光大多數(shù)無機鹽類金屬離子，不能產生熒光，但一些螯合物都能產生很強熒光，可用于痕量金屬離子測定不少有機配體是弱熒光體或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄嬓?，就會使熒光加強或產生熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結構，熒光加強第22頁（四）取代基類型——取代基對熒光物質熒光特征和強度也有很大影響。分成三類：（1）增強熒光取代基

——

有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團因為基團n電子（孤對電子）電子云與苯環(huán)上軌道平行，共享了共軛電子，擴大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強度增強第23頁（2）減弱熒光取代基——-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸電子基團,使熒光波長短移，熒光強度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光對應增強，這種效應為重原子效應。（3）影響不顯著取代基

——-NH3+、-R、-SO3H等第24頁三、環(huán)境對熒光影響1.溶劑影響同一熒光物質在不一樣溶劑中可能表現(xiàn)出不一樣熒光性質普通來說，溶劑極性增強，熒光波長長移，熒光強度增大

2.溫度影響——低溫下測定，提升靈敏度因為輻射躍遷速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強度減弱。

第25頁3.pH影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團芳香族化合物熒光性質受溶液pH影響很大共軛酸堿對是含有不一樣熒光性質兩種型體，含有各自熒光效率和熒光波長例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光第26頁但兩個苯環(huán)相連化合物，又表現(xiàn)出相反性質，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：

—苯酚有熒光無熒光另外，表面活性劑也會影響熒光強度和特征第27頁四、熒光強度與熒光物質濃度關系用強度為I0入射光，照射到液池內熒光物質時，產生熒光，熒光強度If

用儀器測得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時，熒光物質發(fā)射熒光強度If與濃度有下面關系：If=KC熒光強度與物質濃度呈線形關系，If=KC只有在濃度低時使用，熒光物質測定是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時，If與C不呈線形關系，有時C增大，If反而降低因為有時發(fā)生熒光猝滅效應第28頁熒光猝滅

——熒光物質與溶劑或其它物質之間發(fā)生化學反應，或發(fā)生碰撞后使熒光強度下降或熒光效率

f下降稱為熒光猝滅。使熒光強度降低物質稱為熒光猝滅劑氧分子及產生重原子效應溴化物、碘化物等都是常見熒光猝滅劑碰撞猝滅——M+激→M*M*+Q→M+Q+熱自熄滅——熒光物質發(fā)射熒光被熒光物質基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象第29頁（一）熒光分析儀器——主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成光源第一單色器液池檢測器第二單色器檢測器放大器及統(tǒng)計器ex

em與分光光度計有兩點不一樣①兩個單色器②檢測器與激發(fā)光互成直角I0I五、熒光分析儀器第30頁1、光源激發(fā)光源普通要求比吸收測量中光源有更大發(fā)射強度；適用波長范圍寬熒光計中，常使用鹵鎢燈作光源熒光光度計中慣用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光光源；慣用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm譜線最強應用最廣泛一個光源，可發(fā)射250~800nm很強連續(xù)光源第31頁2、單色器熒光計用濾光片作單色器，熒光計只能用于定量分析，不能取得光譜大多數(shù)熒光光度計普通采取兩個光柵單色器，有較高分辨率，能掃描圖譜，既可取得激發(fā)光譜，又可取得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要激發(fā)光，選擇最正確激發(fā)波長

ex

，用此激發(fā)光激發(fā)液池內熒光物質

ex第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質所發(fā)射干擾光，用來選擇測定用熒光波長

em。在選定

em

下測定熒光強度，定量分析第32頁3、樣品池盛放測定溶液，通常是石英材料方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測器把光信號轉化成電信號,放大,直接轉成熒光強度熒光強度普通較弱，要求檢測器有較高靈敏度，熒光光度計采取光電倍增管熒光分析比吸收光度法含有高得多靈敏度，是因為熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提升激發(fā)光強度可大大提升熒光強度5、讀出裝置統(tǒng)計儀統(tǒng)計或打印機打印出結果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜第33頁（二）激發(fā)光譜和熒光光譜熒光為光致發(fā)光，適當激發(fā)光波長需依據(jù)激發(fā)光譜確定——激發(fā)光譜是在固定熒光波長下，測量熒光體熒光強度隨激發(fā)波長改變光譜I

ex固定

em熒光波長取得方法：先把第二單色器波長固定，使測定

em不變，改變第一單色器波長，從200~700nm掃描，讓不一樣波長光照在熒光物質上，測定它熒光強度，以I為縱坐標，ex為橫坐標得左圖，即熒光物質激發(fā)光譜從曲線上找出ex，實際上選波長較長高波長峰第34頁I

em固定

ex激發(fā)光波長取得方法：先把第一單色器波長固定，使激發(fā)

ex不變，改變第二單色器波長，讓不一樣波長光掃描，測定它發(fā)光強度，以I為縱坐標，em為橫坐標得左圖，即熒光物質發(fā)射光譜從曲線上找出最大em第35頁從圖中看出

磷＞熒＞

激圖吸收峰熒光峰磷光峰第36頁六、

熒光分析及應用（一）定量分析方法定量分析依據(jù)If=KC1.標準曲線法——最慣用定量分析方法將已知量標準物質與試樣在相同條件下處理，配制一系列標準液，測定它們相對發(fā)光強度。以相對熒光強度為縱坐標，以標準溶液濃度為橫坐標濃度C1C2C3C4C5Cx熒光強度If1If2If3If4If5IfxIfIfxCxC第37頁2.熒光猝滅法把熒光猝滅用在定量分析上，含有較高靈敏度和選擇性若熒光物質M與猝滅劑Q生成不發(fā)熒光基態(tài)配合物MQM+Q=MQ（非熒光物質）經推導得出：猝滅劑加入前熒光強度猝滅劑加入后試液熒光強度常數(shù)猝滅劑濃度I前/I后與C（Q）有線性關系，可求猝滅劑含量第38頁與標準曲線法相同，對一定濃度熒光體系，分別加入一系列不一樣量猝滅劑Q，配成一個熒光物質—猝滅劑體系，然后在相同條件下測定它們熒光強度，得一曲線取相同熒光物質CMCMCMCM

…

CM

加不一樣量QCQ0CQ1CQ2CQ3…

CQx(CQ0=0)

測IfI前

I后1I后2I后3

…

I后

x

計算I前/I后I前/I后1

I前/I后2I前/I后3

…

I前/I后x

I前/I后xCQxCQI前/I后第39頁3.多組分混合物熒光分析(1)假如兩組分熒光峰相互不干擾,可直接測定可分別在各自

熒波優(yōu)點測定,求出它們含量(2)假如兩組分熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)分,在某一激發(fā)光下一個組分產生熒光峰,另一組分不產生熒光;可選取不一樣激發(fā)光進行測定第40頁Al3+—8-羥基喹啉配合物氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羥基喹啉配合物氯仿溶液

ex=436nm

em=520nm365nm激發(fā)光，Al3+配合物產生熒光，而Ga3+配合物不產生熒光，無熒光峰；

436nm激發(fā)光，Ga3+

配合物產生熒光，而Al3+配合物不產生熒光，無熒光峰在365nm條件下激發(fā)，520nm處測Al3+—8-羥基喹啉配合物，在436nm條件下激發(fā)，520nm處測Ga3+—8-羥基喹啉配合物例：第41頁（二）熒光分析法應用熒光分析法含有靈敏度高、取樣量少等優(yōu)點1.無機化合物分析無機化合物中，能直接產生熒光并應用于測定為數(shù)不多，但與有機化合物生成發(fā)熒光有機