激光共聚焦顯微鏡原理

激光共聚焦顯微鏡原理和應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡LSCM

Laserscanningconfocalmicroscope以激光作為光源，激光器發(fā)出的激光通過照明針孔形成點光源，經(jīng)過透鏡、分光鏡形成平行光后，再通過物鏡聚焦在樣品上，并對樣品內(nèi)聚焦平面上的每一點進行掃描。樣品被激光激發(fā)后的出射光波長比入射光長，可通過分光鏡，經(jīng)過透鏡再次聚焦，到達探測針孔處，被后續(xù)的光電倍增管檢測到，并在顯示器上成像，得到所需的熒光圖像，而非聚焦光線被探測針孔光欄阻擋，不能通過探測針孔，因而不能在顯示器上顯出熒光信號。這種雙共軛成像方式稱為共聚焦。因采用激光作為光源，故稱之為“激光掃描共聚焦顯微鏡”。發(fā)展歷史1957年，MalwinMinsky在其專利中首次闡明了激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的基本工作原理，1967年，Egger第一次成功能共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學(xué)橫斷面，1970年，Sheppard和Wilson推出第一臺單光束共聚集激光掃描顯微鏡1987年，White和Amos在Nature雜志發(fā)表了“Confocalmicroscopycomeofage”,標(biāo)志著LSCM已成為科學(xué)研究的重要工具。普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡圖像的差別激光共聚焦顯微鏡的基本原理利用放置在光源后的照明針孔(P1)和放置在檢測器前的探測針孔(P2)實現(xiàn)點照明和點探測；激光經(jīng)過照明針孔形成點光源，由物鏡聚焦在樣品焦面的某個點上，只有該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光線被探測器阻擋，不能到達PMT探測器，從而提高了成像效果。照明針孔和探測針孔共焦，共焦點為被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面。LSCM的基本組成激光發(fā)射器顯微鏡部分掃描裝置計算機系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)——激光光源LASER“Lightamplificationbystimulatedemissionofradiation”受激發(fā)射的輻射光放大。激光光源的產(chǎn)生受激吸收：處于較低能級的粒子在受到外界的激發(fā)（即與其他的粒子發(fā)生了有能量交換的相互作用，如與光子發(fā)生非彈性碰撞），吸收了能量時，躍遷到與此能量相對應(yīng)的較高能級。自發(fā)輻射：粒子受到激發(fā)而進入的激發(fā)態(tài)，不是粒子的穩(wěn)定狀態(tài)，自發(fā)地從高能級激發(fā)態(tài)（E2）向低能級（E1）躍遷，同時產(chǎn)生光輻射的過程。眾多原子以自發(fā)輻射發(fā)出的光，不具有相位、偏振態(tài)、傳播方向上的一致，是物理上所說的非相干光。受激輻射：除自發(fā)輻射外，處于高能級E2上的粒子還可以另一方式躍遷到較低能級。當(dāng)一個外來光子帶來的能量正好對應(yīng)能級差時（E2-E1），也會引發(fā)粒子以一定的概率，迅速地從能級E2躍遷到能級E1，同時輻射一個與外來光子頻率、相位、偏振態(tài)以及傳播方向都相同的光子的過程。受激輻射激光光源的產(chǎn)生單色性好方向性好亮度高相干和偏振性好激光的特征激光就是受激幅射產(chǎn)生的，激光束里處于相同狀態(tài)的光子是相干的，偏振的，并沿同一方向傳播的。激光器：405，440，635，488，559掃描器系統(tǒng)針孔：confocal一個重要組成部分，它是放在檢測器及激光光源前面的一個小孔，作用是控制光切片的厚度，對實現(xiàn)斷層掃描成像，排除焦面雜散光起關(guān)鍵作用分光鏡：作用是按照波長來改變光線的傳播方向。發(fā)射熒光分色鏡：作用是選擇出一定的波長范圍的光進行檢測，不同型號的儀器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由濾光片、棱鏡和光柵三種類型。檢測器：采用高靈敏度的光電倍增管，其檢測的范圍和靈敏度可根據(jù)強度進行連續(xù)調(diào)節(jié)。熒光顯微鏡系統(tǒng)類型：正置，倒置光路：光源：汞燈、氙燈，觀察分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分與位置。

源發(fā)濾光片：選擇適合熒光物質(zhì)激發(fā)波波長的范圍

雙色分光鏡：初步分開激發(fā)和發(fā)射光組件、

阻濾片：獲得更純的發(fā)射熒光

物鏡：激發(fā)和發(fā)射都由同一物鏡實現(xiàn)。

目鏡：10×用于LSCM的熒光顯微鏡：側(cè)面有掃描器接口，裝有微量步進馬達，有防振裝置，有光路轉(zhuǎn)換裝置，配高數(shù)值孔徑的物鏡。計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件基本功能多種圖像掃描方式2D:xy，xz，xt3D：XYZ，Xyt4D：XYZt光譜掃描多色熒光同時檢測：圖像分析與定量處理：3D重建，立體重建，斷面輪廓分析。圖像分析：特定區(qū)域的強度、周長的測量，以及延時觀察分析t等。熒光光譜拆分組織和細(xì)胞中的熒光來源自發(fā)熒光：指組織細(xì)胞不經(jīng)過任何熒光染色便能在短波長光的激發(fā)下發(fā)射出的熒光，GFP就具有自發(fā)熒光，是標(biāo)記靶蛋白的特異性熒光探針。熒光染色：很多熒光染料與組織細(xì)胞作用，能夠在光的作用發(fā)出特征波長的熒光，借以觀察組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和功能。有些可做活體染色。免疫熒光：熒光抗體法產(chǎn)生熒光。外源性熒光物質(zhì)進入組織內(nèi)產(chǎn)生的熒光。某些藥物誘發(fā)熒光：生物胺類能與某些醛類物質(zhì)在一定條件下縮合而發(fā)生熒光。酶致熒光：某些酶的反應(yīng)能夠發(fā)射熒光。LSCM主要用于測定具有熒光的樣品，因此對本身沒有特征熒光的生物樣品，就需要用熒光標(biāo)記的方法使樣品待測物質(zhì)具有熒光，然后再進行檢測。熒光探針熒光標(biāo)記與熒光探針：采用一定的標(biāo)記物，使樣品待測物質(zhì)具有特定的熒光特征，這種標(biāo)記物被稱為熒光探針。這種組樣品賦予特征熒光的操作過程稱為熒光標(biāo)記。熒光探針的種類：蛋白質(zhì)、單糖和多糖探針，細(xì)胞器探針、核酸探針、細(xì)胞活性探針、膜結(jié)合受體探針等。如何選擇探針根據(jù)實驗?zāi)康拇_定需要檢定的指標(biāo)確定可供選擇的熒光探針的范圍：根據(jù)需要檢測的指標(biāo)，選擇應(yīng)成熟的探針或標(biāo)記方法?？赏ㄟ^查找文獻和試劑公司產(chǎn)品目錄確定可以標(biāo)記待測物的熒光探針的種類或范圍?？紤]熒光探針的特性：熒光探針與樣品的反應(yīng)特性（與待測分子或離子反應(yīng)的選擇性或?qū)Ｒ恍缘龋?，熒光探針的靈敏度和熒光強度，熒光探針標(biāo)記后樣品的光譜特征（需要在儀器的檢測范圍內(nèi)），熒光的穩(wěn)定性，樣品中多重?zé)晒獾南嗷ビ绊懀ū苊夤庾V交叉）。熒光樣品的制備要求熒光標(biāo)記反應(yīng)特異性強，熒光信號定位準(zhǔn)確保持樣品應(yīng)有的形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性熒光信號響應(yīng)百準(zhǔn)確靈敏，具有可重復(fù)性熒光強度適度熒光穩(wěn)定性好。樣品的熒光分布均勻兩種或兩種以上的熒光信號之間熒光光譜交叉可以得到消除。圖象背景干凈，干擾雜質(zhì)少。熒光樣品的制備過程樣品的預(yù)處理組織切片樣品的處理：活組織切片，無需固定，可觀察和測定活性狀態(tài)下的一些生理指標(biāo)，缺點是保存條件高，時間短，切片厚。冰凍切片：熒光背景低，引入雜質(zhì)干擾少。固定組織切片：易操作，樣品易保存，但易引入干擾熒光。細(xì)胞樣本制備：雜細(xì)胞的干擾實驗結(jié)果，需要注意鑒別細(xì)胞的種類和純度。細(xì)胞密度約在20-80%，活的細(xì)胞需用專用培養(yǎng)皿。用熒光探針標(biāo)記樣品標(biāo)記方式：直接標(biāo)記，生物樣品與熒光探針直接作用，使樣品具有熒光。間接標(biāo)記法：熒光探針將某些特定分子標(biāo)記，這些特定分子再與細(xì)胞作用，使樣品具有熒光，如免疫熒光法，熒光標(biāo)記的藥物。顯微注射法：利用顯微注射向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入熒光探針，此法得到的熒光細(xì)胞少，適合監(jiān)測少量細(xì)胞。膜通透法：利用透膜劑，低滲培養(yǎng)液短期刺激增強探針跨膜能力，從而使探針進入細(xì)胞中。確定熒光探針標(biāo)記樣品的條件：標(biāo)記探針的濃度，反應(yīng)溫度，時間等。熒光探針標(biāo)記的注意事項熒光強度過高：看不清細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，不利于形態(tài)觀察，可降低探針濃度，減少反應(yīng)時間。熒光強度弱：熒光探針濃度過低，標(biāo)記條件不當(dāng)，探針溶解不充分，探針選擇錯誤等。在操作過程中，避免對樣品造成損傷防止影響實驗結(jié)果熒光標(biāo)記要避光進行。防止非特異性標(biāo)記，設(shè)立正確的對照組。熒光標(biāo)記后要盡快上機采集圖像。LSCM的優(yōu)越性動態(tài)連續(xù)掃描及三維圖像重組LSCM可以對對活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片樣品的不同層面進行連續(xù)逐層掃描,來獲得各個層面的圖像，即所謂的“無損傷的光學(xué)切片”。激光掃描共聚焦顯微鏡掃描的每個層面之間的間距可以達到0.1um甚至更小。獲得的圖像通過計算機重組，可獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像。與普通光學(xué)顯微鏡獲得的圖像相比，LSCM所得到的重組三維圖像清晰度高、立體感強,可通過計算機軟件對細(xì)胞內(nèi)所研究的結(jié)構(gòu)進行各種測量，對細(xì)胞內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)和某些物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位方面的研究中有廣泛的應(yīng)用。同時多種物質(zhì)標(biāo)記利用LSCM，通過對膜上、胞漿內(nèi)多種物質(zhì)的熒光標(biāo)記，可以實現(xiàn)在同一樣品上同時進行多重物質(zhì)的觀察，比如檢測細(xì)胞內(nèi)鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率及動態(tài)變化LSCM的優(yōu)越性瞬時分辨率高可以實時動態(tài)觀察活體組織標(biāo)本。LSCM的熒光檢測器可以毫秒級或微秒級的速度檢測熒光，即其時間分辨率極高，能對細(xì)胞內(nèi)的分子進行功能性動態(tài)觀察。LSCM技術(shù)可對活細(xì)胞在無損傷處理的情況下進行觀察，跟蹤活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)和生理過程隨時間變化的情況，得到實時動態(tài)的連續(xù)圖像。LSCM的優(yōu)越性高質(zhì)量數(shù)字圖像普通顯微鏡采用的自然光或燈光是一種場光源，標(biāo)本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射光或散射光的干擾。LSCM以激光為光源，激光具有單色性強、方向性好、高亮度﹑相干性好等優(yōu)點，可以避免普通顯微鏡的缺點。一般常用的氣體激光器如氬(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。由于LSCM的樣品焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，這樣就避免了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡由于光散射造成的圖像信噪比降低，圖像清晰度和分辨率不高的缺點。而且，LSCM的圖像是以電信號的形式記錄下來的，可以采用各種模擬的和數(shù)字的電子技術(shù)進行各種圖像處理。LSCM的優(yōu)越性LSCM在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用組織和細(xì)胞中分子或結(jié)構(gòu)的定位，定量分析：利用LSCM可以在細(xì)胞原位用特異的熒光標(biāo)記探針標(biāo)記出核酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、磷脂、多糖、受體等分子，實現(xiàn)對其定位、定性和定量檢測，也可觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。如在細(xì)胞原位檢測核酸、原位檢測蛋白，抗體及其他分子，檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞器觀察及測定，檢測細(xì)胞整合、觀察細(xì)胞骨架，檢測細(xì)胞間縫隙連接通訊等多種應(yīng)用。標(biāo)本的制備方法主要有免疫熒光組織和細(xì)胞化學(xué)法、熒光蛋白標(biāo)記分子法，熒光細(xì)胞染料標(biāo)記法等。LSCM不但可對單標(biāo)記或雙標(biāo)記細(xì)胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進行定量分析，還可利用沿縱軸上移動標(biāo)本進行多個光學(xué)切片的疊加形成組織或細(xì)胞中熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)的總體圖像，以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。原位檢測細(xì)胞中的核酸用于細(xì)胞核的定位及形態(tài)學(xué)觀察，檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀察等。常的熒光探針：PI,EB，DAPI,AO,TOTO-1等熒光原位雜交（FISH）利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術(shù)。用標(biāo)記有熒光的DNA或RNA為探針，在原位測組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA片斷，從而對染色體或基因異常的細(xì)胞、組織樣本進行檢測和診斷。把熒光信號的高靈敏度、安全性、直觀性和原位雜交的高準(zhǔn)確性結(jié)合起來。原位檢測蛋白質(zhì)及其它分子常用熒光探針FITC,TRITC,Cy3，Cy5等免疫熒光標(biāo)記：將抗體標(biāo)記上熒光素，與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的抗原結(jié)合后，通過檢測特征性的熒光，定位，定性、定量檢測樣品中的抗體。既有免疫反應(yīng)的特異性，又有熒光檢測的敏感性。熒光蛋白：跟蹤組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達及蛋白定位的標(biāo)記物GFP，綠色熒光蛋白，在任何活細(xì)胞中都表達，可作為活細(xì)胞的分子探針，GFP連接上目的基因后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可分析目的基因的生物學(xué)功能和特性?？蓪罴?xì)胞中的蛋白質(zhì)進行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察，可實時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達，如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位，蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位，還可用于觀察分子的運動，及蛋白之間的相互作用。檢測細(xì)胞凋亡AnnexinV/PI雙染：AnnexinV是檢測凋亡早期細(xì)胞膜損傷的方法，凋亡早期細(xì)胞膜膜磷脂失去平衡，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細(xì)胞內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露于細(xì)胞外環(huán)境中，AnnexinV與磷脂具有高度親和力，可與轉(zhuǎn)移到膜外的PS結(jié)合。對于凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能透膜而使其染紅。兩者配合使用可以初步確定細(xì)胞的凋亡進程。檢測細(xì)胞器標(biāo)記線粒體：Rodamin123，JC1,MitotrackerGreenFM,MitoTrackerRed標(biāo)記溶酶體：Lysotrackergreen，Lysotrackerblue,Lysotrackerred標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：DiOC6標(biāo)記高爾基體：NBDC6-ceramine斑馬魚腦部的血管與神經(jīng)元

綠色：神經(jīng)元

紅色：血管藍色細(xì)胞核，綠色微管LSCM在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用活體細(xì)胞和組織功能的實時動態(tài)監(jiān)測：利用相應(yīng)的特異性熒光標(biāo)記所要觀察的物質(zhì)后，用LSCM可實時動態(tài)監(jiān)測單個細(xì)胞不同部位或不同組織區(qū)域接受刺