樹(shù)突狀細(xì)胞體外刺激對(duì)HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞影響的研究課件

樹(shù)突狀細(xì)胞體外刺激對(duì)HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞影響的研究

張恒輝何豫趙鴻樸文花劉茂昌席宏麗于敏王貴強(qiáng)北京大學(xué)第一醫(yī)院感染疾病科北大醫(yī)院感染科張恒輝樹(shù)突狀細(xì)胞體外刺激對(duì)HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞影響的研究張恒1研究背景北大醫(yī)院感染科張恒輝研究背景北大醫(yī)院感染科張恒輝2HBV慢性感染主要原因HBV特異細(xì)胞免疫功能的低下T細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能異常研究背景（1）特異性CTL數(shù)量少低反應(yīng)HBV慢性感染HBV特異細(xì)胞免疫T細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）慢3HBV慢性感染主要原因HBV特異細(xì)胞免疫功能的低下T細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能異常促進(jìn)DC成熟、恢復(fù)DC的功能增強(qiáng)DC激活特異性抗病毒免疫反應(yīng)打破免疫耐受徹底清除病毒研究背景（1）特異性CTL數(shù)量少低反應(yīng)獲得高頻數(shù)、功能強(qiáng)HBV特異性的CTLHBV慢性感染HBV特異細(xì)胞免疫T細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）慢4促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)DC功能CpGCD40LAd-IL-12轉(zhuǎn)染Poly（I：C）關(guān)于恢復(fù)DC功能的研究研究背景（2）促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)DC功能CpGCD40LAd-IL-12P5研究目的本研究通過(guò)在體外進(jìn)行慢性乙型肝炎患者單核細(xì)胞的DC方向轉(zhuǎn)化，并輔以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增強(qiáng)DC的成熟和功能。將患者DC經(jīng)HBVcore18-27肽負(fù)載后，刺激病人自身的T淋巴細(xì)胞。并用Elispot法及本研究室構(gòu)建的HLA-A2肽四聚體復(fù)合物檢測(cè)病毒特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能。研究目的本研究通過(guò)在體外進(jìn)行慢性乙型肝炎患者單核細(xì)胞的DC方6研究對(duì)象和方法北大醫(yī)院感染科張恒輝研究對(duì)象和方法北大醫(yī)院感染科張恒輝7研究對(duì)象22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。HBeAg+患者16例、HBeAb+患者6例。HBVDNA均≥104copy/ml。排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年沒(méi)有接受過(guò)抗病毒治療。研究對(duì)象22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。8研究方法HLA-A2型別鑒定

DC的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定

以樹(shù)突狀細(xì)胞為抗原遞呈細(xì)胞體外誘導(dǎo)病毒抗原特異性T細(xì)胞

Elispot檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)

MHC-肽四聚體檢測(cè)HBVcore18-27肽特異性CD8+T細(xì)胞研究方法HLA-A2型別鑒定9HLA-A*02型別鑒定

外周血淋巴細(xì)胞標(biāo)記鼠抗人HLA-A02單抗；流式細(xì)胞儀檢測(cè)；每份標(biāo)本均設(shè)自身陰性對(duì)照。HLA-A*02型別鑒定外周血淋巴細(xì)胞標(biāo)記鼠抗人HLA-A10樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定

分離病人PBMC；GM-CSF、IL-4刺激下DC培養(yǎng)轉(zhuǎn)化；Poly(

I:C)刺激；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表達(dá)，進(jìn)行功能及成熟度的鑒定。樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定分離病人PBMC；11以DC為抗原遞呈細(xì)胞體外誘導(dǎo)HBV抗原特異性T細(xì)胞

培養(yǎng)成熟DC負(fù)載HBV核心肽（HBVcore18-27FLPSDFFPSV）；DC與自體T細(xì)胞共培養(yǎng)48-72h；單純IL-2維持未經(jīng)自身樹(shù)突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞組為對(duì)照。以DC為抗原遞呈細(xì)胞體外誘導(dǎo)HBV抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)成熟12

Elispot檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)

封閉種板孵育：37℃，5%CO2孵育15-20h；顯色計(jì)數(shù)：CTLIMMUNOSPOT分析儀計(jì)數(shù)，取兩復(fù)孔的平均值Elispot檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)封閉13

MHC-肽四聚體檢測(cè)HBVcore18-27肽特異性CD8+T細(xì)胞PE-HLA-A0201/HBVcore18-27tetramer和FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記；流式細(xì)胞儀檢測(cè)；慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV四聚體標(biāo)記作為陰性對(duì)照；MHC-肽四聚體檢測(cè)HBVcore18-27肽特異性C14統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以

x±SD表示。用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用配伍組方差分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示。用SPSS10.0軟件15結(jié)果北大醫(yī)院感染科張恒輝結(jié)果北大醫(yī)院感染科張恒輝16DC的擴(kuò)增、表型鑒定及Poly(I:C)對(duì)其表面分子表達(dá)的影響組別例數(shù)HLA-DR+CD80+CD83+CD86+CD14+CD11c+未加Poly(I:C)組2283.6±6.923.4±6.619.3±2.284.2±6.38.4±2.895.5±3.1Poly(I:C)作用組2288.8±7.839.3±8.6*30.7±5.6*85.4±3.23.7±2.3*93.4±2.9慢性乙型肝炎病人DC經(jīng)Poly(I:C)作用前后表面分子表達(dá)的比較*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）DC的擴(kuò)增、表型鑒定及Poly(I:C)對(duì)其表面分子表達(dá)的17經(jīng)Poly(I:C)刺激后：CD80、CD83表達(dá)明顯上調(diào)。CD14的表達(dá)明顯下降。Poly(I:C)對(duì)DC表面分子表達(dá)的影響經(jīng)Poly(I:C)刺激后：Poly(I:C)對(duì)DC表面分子18Elispot檢測(cè)HBV特異性的

分泌IFN-γ的CTL細(xì)胞頻數(shù)的比較

1231.慢乙肝病人體外經(jīng)IL-2維持生長(zhǎng)的T細(xì)胞；2.經(jīng)自體DC刺激后的T細(xì)胞；3.DC經(jīng)Poly（I:C）作用后刺激的T細(xì)胞Elispot檢測(cè)HBV特異性的

分泌IFN-γ的CTL細(xì)19樹(shù)突狀細(xì)胞激活的分泌IFN-γ的CTL細(xì)胞的頻數(shù)分布圖

T：慢性乙型肝炎患者體外經(jīng)IL-2維持生長(zhǎng)的T細(xì)胞；DC-T：經(jīng)樹(shù)突狀細(xì)胞刺激后的T細(xì)胞；PDC-T：樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)Poly（I:C）作用后刺激的T細(xì)（“━”表示均數(shù)）樹(shù)突狀細(xì)胞激活的分泌IFN-γ的CTL細(xì)胞的頻數(shù)分布圖T：20Elispot檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明病人T細(xì)胞在經(jīng)自體樹(shù)突狀細(xì)胞刺激后與未刺激前相比，分泌IFN-γ的CTL細(xì)胞頻數(shù)均值由16上升為46，約為2.9倍；發(fā)現(xiàn)經(jīng)Poly（I:C）作用后的樹(shù)突狀細(xì)胞所活化的特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)明顯升高，均值為98，和未經(jīng)樹(shù)突狀細(xì)胞刺激組和樹(shù)突狀細(xì)胞刺激組相較，分別升高6.1和2.1倍。Elispot檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明病人T細(xì)胞在經(jīng)自體樹(shù)突狀細(xì)胞刺激后21Tetramer流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HBVcore18-27特異性CD8+T細(xì)胞結(jié)果

PE-HLA-A0201/HBVcore18-27tetramer和FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記T細(xì)胞，行流式檢測(cè)。以淋巴細(xì)胞設(shè)門，收集門內(nèi)細(xì)胞50,000個(gè),右上象限細(xì)胞數(shù)/右上及右下象限細(xì)胞數(shù)之和即為抗原特異性CTL占CD8+細(xì)胞數(shù)比例（圖中右上象限的百分比值）。Tetramer流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)PE-HLA-A0201/221．PE-羊抗鼠IgG/FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記的T細(xì)胞；2.IL-2維持的自身T細(xì)胞；3.與樹(shù)突狀細(xì)胞作用的T細(xì)胞；4.與poly（I︰C）刺激后的樹(shù)突狀細(xì)胞作用的T細(xì)胞1．PE-羊抗鼠IgG/FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記的T細(xì)胞；23圖3.tetramer檢測(cè)特異CD8+T細(xì)胞的頻數(shù)分布圖

Control：非相關(guān)肽四聚體標(biāo)記的T細(xì)胞；T：IL-2維持的自身T細(xì)胞；DC-T：與樹(shù)突狀細(xì)胞作用的T細(xì)胞；PDC-T：與poly（I︰C）刺激后的樹(shù)突狀細(xì)胞作用的T細(xì)胞。圖3.tetramer檢測(cè)特異CD8+T細(xì)胞的頻數(shù)分24Tetramer結(jié)果說(shuō)明患者T細(xì)胞在經(jīng)自體樹(shù)突狀細(xì)胞刺激后與未刺激前相比，HBVcore18-27肽特異的CTL頻數(shù)均值由0.77%上升至1.92%，提高約2.5倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。經(jīng)Poly（I:C）刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞活化后，HBVcore18-27表位特異性CTL的頻數(shù)均值上升為3.49%，分別為前2組的4.5和1.8倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.001）。Tetramer結(jié)果說(shuō)明患者T細(xì)胞在經(jīng)自體樹(shù)突狀細(xì)胞刺激后25討論討論26討論（1）樹(shù)突狀細(xì)胞能激活幼稚T細(xì)胞，調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的功能；在病毒抗原攝取、遞呈及特異性激活抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，是抗感染免疫的中心環(huán)節(jié)。

HBV急性感染時(shí)：多克隆、高反應(yīng)性的病毒特異性CTL——可迅速、徹底清除病毒；HBV慢性感染時(shí)：?jiǎn)我豢寺?、弱反?yīng)性的病毒特異性CTL。

討論（1）樹(shù)突狀細(xì)胞能激活幼稚T細(xì)胞，調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的功27討論（2）聚肌胞Poly(I:C)是一種Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的強(qiáng)誘生劑。Poly（I:C）能夠有效地誘導(dǎo)體外單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，并維持樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài)。

CD83：DC成熟；行使功能CD83表達(dá)DC成熟及功能改善 CD14：?jiǎn)魏思?xì)胞的特異性分子標(biāo)記CD14表達(dá) DC分化程度改善討論（2）聚肌胞Poly(I:C)是一種Ⅰ型和Ⅱ型干擾28討論（3）MHC-肽四聚體染色法檢測(cè)HBVcore18-27特異性CTL的數(shù)量：高特異性、敏感性對(duì)特異性CTL進(jìn)行定性、定量分析用于感染、腫瘤、自身免疫性疾病等的細(xì)胞免疫學(xué)研究和治療效果監(jiān)測(cè)。Elispot檢測(cè)活化的分泌IFN-γ的有功能的病毒特異性T細(xì)胞兩種技術(shù)結(jié)合能夠更準(zhǔn)確、客觀地評(píng)價(jià)體外轉(zhuǎn)化的樹(shù)突狀細(xì)胞活化特異性T淋巴細(xì)胞的能力。討論（3）MHC-肽四聚體染色法檢測(cè)HBVcore1829結(jié)論北大醫(yī)院感染科張恒輝結(jié)論北大醫(yī)院感染科張