女貞子多糖除蛋白工藝的研究

女貞子多糖除蛋白工藝的研究

女貞子是木犀科多年生樹木女貞的干燥成熟果實。它被記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。它是一種盲目常用的中藥。具有糾正肝腎、強(qiáng)筋煥黑的功效。主要用于強(qiáng)腰膝、烏須發(fā)、陰陽虛熱、頭暈耳鳴等癥狀?，F(xiàn)代藥理研究明表明,女貞子多糖具有顯著的免疫增強(qiáng)和抗氧化、抗衰老作用。有化學(xué)研究表明,女貞子多糖(polysaccharidefromLigustrumlucidumAit.,PLLA)主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖及巖藻糖4種糖組成。近年來,對女貞子的研究主要集中在其脂溶性成分如齊墩果酸、熊果酸等,而女貞子多糖的研究較少。由于粗多糖的水提液在醇沉的過程中蛋白質(zhì)會一起沉淀下來,影響后續(xù)的分離純化研究,因此確定除蛋白質(zhì)效率高且多糖損失率小的除蛋白方法是很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。本實驗以多糖損失率和蛋白質(zhì)清除率為指標(biāo),針對女貞子多糖選用了Sevag法、三氯乙酸法(TCA法)、三氯乙酸-Sevag法3種不同的除蛋白方法,并采用正交試驗法優(yōu)選了三氯乙酸法除蛋白的工藝,旨在篩選簡單、可行的女貞子多糖除蛋白方法,為其他植物多糖的除蛋白工藝研究提供一定的參考。1血清生化指標(biāo)各化學(xué)試劑女貞子購于安徽亳州藥材市場,經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司吳舟主管藥師鑒定。UV2550—PC紫外可見分光光度計;TDL—5—A型離心機(jī);BP—211D型電子天平;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);D-無水葡萄糖(中國藥品生物制品檢定所,批號為110833-200503);氯仿、正丁醇、三氯乙酸、苯酚、濃硫酸均為國產(chǎn)分析純。2方法和結(jié)果2.1女貞子粗多糖的提取取女貞子粗粉4kg,加10倍體積的乙醇回流提取2次,每次2h,濾過,藥渣揮干乙醇后,加15倍量的水提取2次,每次2h,合并提取液,減壓濃縮至藥液相對密度為1.05(20~25℃),加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%,靜置12h,離心,沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次,抽濾,真空干燥后得到女貞子粗多糖約240g。2.2測定茶多酚和蛋白質(zhì)的方法多糖測定采用改良的苯酚-硫酸法;蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法。2.2.1具塞試劑溶液制備稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品14.74mg置100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度為147.4μg/mL儲備液。精密吸取儲備液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL分別置于具塞試管中,各加蒸餾水使總體積為1.0mL,再分別加6%苯酚試液1.0mL,搖勻,迅速滴加濃硫酸5.0mL,搖勻后置沸水浴中加熱15min,冰水中15min,再室溫放置30min,取出;另以蒸餾水1.0mL加苯酚和硫酸,同上操作作為空白對照,于490nm波長處測定吸光度,以吸光度(A)為橫坐標(biāo),葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo),進(jìn)行回歸處理,得回歸方程為C=0.01058A+0.00228,r=0.99992,表明葡萄糖在0~132.66μg/mL具有良好的線性關(guān)系。2.2.2葡萄糖樣品中的測量精密量取樣品溶液1mL,自標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下“再分別加6%苯酚試液1.0mL”起測定其吸光度值,平行3次。2.2.3測定波長的選擇稱取牛血清白蛋白15.14mg,置10mL量瓶中,加水溶解后稀釋至刻度制成質(zhì)量濃度為151.4μg/mL貯備液。分別吸取貯備液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL,加水稀釋至1mL,向各管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,混合均勻后以蒸餾水為空白,5min后在595nm波長處測定吸光度值。以吸光度(A)為橫坐標(biāo),牛血清白蛋白質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo),得回歸方程為:C=0.00323A-0.03726,相關(guān)系數(shù)r=0.99937,表明牛血清白蛋白在0~136.26μg/mL呈良好的線性關(guān)系。2.2.4測定波長的確定精密量取樣品溶液1mL,加入考馬斯亮藍(lán)貯備液5mL,振搖,以1mL水為空白,5min后在595nm波長處測定吸光度值,平行3次。2.3質(zhì)清除率、多糖損失率、多糖最佳量的確定采用蛋白質(zhì)清除率和多糖損失率作為指標(biāo)進(jìn)行考察。蛋白質(zhì)清除率=脫蛋白前蛋白質(zhì)的量-脫蛋白后蛋白質(zhì)的量/脫蛋白前蛋白質(zhì)的量×100%多糖損失率=脫蛋白前多糖的量-脫蛋白后多糖的量/脫蛋白前多糖的量×100%2.4女貞子提取茶多酚的工藝2.4.1女貞子粗糖溶液的制備取2.1項下制得的女貞子粗多糖20g,加200mL水超聲溶解,配制3份質(zhì)量濃度為10%的女貞子粗多糖水溶液。2.4.2女貞子多糖的提取按照女貞子粗多糖水溶液、氯仿、正丁醇的體積比為16∶4∶1加入氯仿與正丁醇,手搖20min后于分液漏斗中靜置2h,離心取上清液,濃縮至相對密度為1.05(20~25℃),加入乙醇至體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%,靜置12h,離心得沉淀物,依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,抽濾,干燥后得女貞子多糖,測定多糖和蛋白質(zhì),結(jié)果見圖1。2.4.3女貞子粗多糖的提取配制3%、5%、7%、10%、15%、20%質(zhì)量濃度的三氯乙酸溶液,分別與女貞子粗多糖水溶液等體積混合,充分?jǐn)噭?4℃靜置2h,離心,上清液用1mol/LNaOH溶液中和至pH中性,濃縮至相對密度為1.05(20~25℃),加入乙醇至體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%,靜置12h,離心得沉淀物,依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,抽濾,干燥后得女貞子粗多糖,測定多糖和蛋白質(zhì),結(jié)果見圖1。2.4.4女貞子粗多糖的提取按照女貞子粗多糖水溶液、10%三氯乙酸、Sevag試劑[氯仿-正丁醇(4∶1)]的體積比為4∶4∶1加入10%三氯乙酸和Sevag試劑,手搖20min后于分液漏斗中4℃靜置2h,離心,上清液用1mol/LNaOH溶液中和至pH中性,濃縮至相對密度為1.05(20~25℃),加入乙醇至體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%,靜置12h,離心得沉淀物,依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,抽濾,干燥后得女貞子粗多糖,測定多糖和蛋白質(zhì),結(jié)果見圖1。2.4.5氯乙酸除蛋白法第一次蛋白質(zhì)清除率為9.由圖1可知,女貞子多糖采用Sevag法除蛋白,反復(fù)處理4次可以使多糖損失相對較少,而蛋白質(zhì)的清除率較高,6次除蛋白總的清除率為34.57%,而多糖的損失率達(dá)到了39.19%。除蛋白的主要效果在前4次,蛋白質(zhì)清除率達(dá)到了30.36%;TCA法除蛋白,蛋白質(zhì)的清除率和多糖損失率隨著三氯乙酸濃度的升高而升高,但是多糖損失率的增長幅度比較大。如3%三氯乙酸溶液的蛋白清除率達(dá)到了75.23%,而多糖損失率只有6.21%。三氯乙酸濃度越高,多糖的降解率就越大,損失也越多。綜合各種因素考慮,10%的三氯乙酸除蛋白效果較為理想;三氯乙酸-Sevag法第一次蛋白質(zhì)的清除率為50.24%,多糖損失率為9.31%。總體上比較,該法的蛋白質(zhì)清除率介于Sevag法和三氯乙酸法之間,且以第3次效果比較好。由上述數(shù)據(jù)可以得出,3種除蛋白的方法各有利弊。在除蛋白的過程中,氯仿和正丁醇使蛋白質(zhì)變性形成凝膠物,部分多糖物質(zhì)也會隨之沉淀,造成多糖的損失;此外,Sevag法也很難除清少量與多糖結(jié)合很牢或被多糖包裹的蛋白質(zhì)。因此經(jīng)典的Sevag法雖然溫和且在避免多糖的降解方面有較好的效果,但該法效率低,需要消耗大量的有機(jī)試劑,對于蛋白質(zhì)量較高的女貞子多糖來說并不是較好的除蛋白方法。三氯乙酸法除蛋白效率較高,但是由于三氯乙酸的酸性較強(qiáng),容易導(dǎo)致多糖的降解,因此控制好三氯乙酸的濃度尤為重要。綜合上述結(jié)果,在兼顧多糖損失率和蛋白質(zhì)清除率的情況下,本實驗選用三氯乙酸法用于去除女貞子粗多糖中的蛋白質(zhì),并進(jìn)一步設(shè)計正交試驗來優(yōu)化其除蛋白的工藝。2.5三氯乙酸法的除污染技術(shù)的優(yōu)化2.5.1氯乙酸除蛋白工藝優(yōu)化正交試驗根據(jù)文獻(xiàn)資料及預(yù)實驗結(jié)果,選取10%三氯乙酸的用量、除蛋白次數(shù)、靜置時間為考察因素,每個因素選擇3個考察水平,進(jìn)行L9(3)4正交試驗,以多糖量和蛋白質(zhì)清除率優(yōu)選三氯乙酸除蛋白的工藝,因素水平見表1。2.5.2女貞子粗多糖提取準(zhǔn)確稱取9份女貞子粗多糖各20g于具塞試管,加入200mL水,充分振搖使溶解,按照正交試驗安排進(jìn)行女貞子粗多糖除蛋白、醇沉、減壓干燥、精密稱定,測定各實驗多糖粗品中多糖和蛋白質(zhì),以綜合評分(綜合評分=多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)×50%+蛋白質(zhì)清除率×50%)為指標(biāo),試驗安排及試驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。3種因素對女貞子粗多糖除蛋白的主次順序依次為三氯乙酸用量、除蛋白次數(shù)、放置時間。在兼顧多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白質(zhì)清除率的情況下,選取各影響因素的最優(yōu)水平組合為A1B1C1,即以1倍量的三氯乙酸除蛋白1次,靜置2h,離心為女貞子粗多糖除蛋白的優(yōu)選工藝。3女貞子多糖除蛋白的篩選多糖主要以兩種形式存在,一是純糖鏈,另一種是糖鏈與肽