大鼠皮內(nèi)受藥試驗方法的選擇

大鼠皮內(nèi)受藥試驗方法的選擇

隨著中藥廣泛應(yīng)用于臨床實踐，其副作用的發(fā)生率也逐年增加，尤其是類過敏試驗。類過敏反應(yīng)最常見的皮膚癥狀為顏面潮紅、瘙癢、皮疹、紅斑、水腫等?；诖?本課題組前期對大鼠皮膚類過敏試驗方法學(xué)進行了系統(tǒng)研究,就該方法檢測藥物類過敏反應(yīng)的適用性進行了初步考察。本研究在此基礎(chǔ)上,選用了常用的有臨床類過敏反應(yīng)陽性報道的造影劑、中藥注射劑和化學(xué)合成藥作為受試藥物,以大鼠皮膚類過敏試驗評價其類過敏反應(yīng),以進一步考察該方法的適用性,旨在為科學(xué)評價注射類藥物臨床前類過敏反應(yīng)提供可靠的檢測方法。1材料表面1.1實驗動物及飼養(yǎng)SD大鼠,清潔級,雌性,180~220g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(滬)2008-0016,上述動物均在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心清潔級飼養(yǎng)室飼養(yǎng),試驗期間自由飲水、攝食,室內(nèi)溫度20~22℃,相對濕度45%~70%。1.2抗高血壓藥、茶質(zhì)、小黃連碘普羅胺注射液(簡稱“碘普羅胺”,規(guī)格76.89g/100mL,拜耳醫(yī)藥保健有限公司產(chǎn)品,批號962A);碘海醇注射液(簡稱“碘海醇”,規(guī)格30g(I)/100mL,通用電氣藥業(yè)(上海)有限公司產(chǎn)品,批號12017959);復(fù)方泛影葡胺注射液(簡稱“泛影葡胺”,規(guī)格12g/20mL(以泛影葡胺與泛影酸鈉總量計),上海旭東海普藥業(yè)產(chǎn)品,批號II121105)。銀杏葉提取物注射液(簡稱“金納多”,規(guī)格17.5mg/5mL,中豪國際有限公司產(chǎn)品,批號G4242);注射用雙黃連(凍干)(簡稱“雙黃連”,規(guī)格600mg/支,哈藥集團中藥二廠產(chǎn)品,批號1302008);清開靈注射液(簡稱“清開靈”,規(guī)格10mL/支,吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品,批號11043008);生脈注射液(簡稱“生脈”,規(guī)格10mL/支,上海和黃藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號120603);脈絡(luò)寧注射液(簡稱“脈絡(luò)寧”,規(guī)格10mL/支,金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠產(chǎn)品,批號20120645);喜炎平注射液(簡稱“喜炎平”,規(guī)格50mg/2mL,江西青峰藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號2013032103);鹽酸川芎嗪(貴州景峰注射劑有限公司提供);Compound48/80(N-甲基-對甲氧基苯乙胺和甲醛縮合產(chǎn)生的聚合物。具有促進組胺釋放的作用。簡稱“C48/80”,Sigma公司,批號039K4023);分析純丙酮(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號20120504);伊文思藍(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號W20111101)。1.3主要設(shè)備2方法2.1類過敏反應(yīng)陽性檢測SD大鼠30只,隨機分為5組,每組6只,稱定質(zhì)量后25%烏拉坦(4mL/kg)麻醉,背部剃毛3cm×4cm,在其脊柱兩側(cè)皮內(nèi)注射生理鹽水(陰性對照組),C48/80(陽性對照組),不同劑量的碘普羅胺、碘海醇、泛影葡胺(0.5、1mL/mL)、金納多(0.35、0.7mg/mL)、雙黃連(7.2、14.4mg/mL)、清開靈(0.4、0.8mL/mL)、生脈(0.24、0.48mL/mL)、脈絡(luò)寧(0.08、0.16mL/mL)、喜炎平(2、4mg/mL)、鹽酸川芎嗪溶液(1.0、2.0mg/mL),50μL/點,立即尾靜脈注射0.5%伊文思藍染液,1mL/只,15min后頸動脈放血處死大鼠,剪取背部皮膚,拍照并測量藍斑直徑(設(shè)定藍斑直徑大于0.5cm為類過敏反應(yīng)陽性)。2.2統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計方法運用SPSS18統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料采用ue0af±s表示,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1組患者藥物組和鹽水組實驗結(jié)果比較見表1碘海醇和泛影葡胺評定為類過敏反應(yīng)陽性,且藥物組與生理鹽水組比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);碘普羅胺評定為類過敏反應(yīng)陰性。見表1。3.2中藥口服的大鼠皮膚過敏3.2.1組過敏反應(yīng)陽性及與鹽水組過敏反應(yīng)比較金納多在臨床劑量時評定為類過敏反應(yīng)陰性,2倍臨床劑量時評定為類過敏反應(yīng)陽性,且與生理鹽水組比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);雙黃連在臨床劑量和2倍臨床劑量時,評定為類過敏反應(yīng)陽性,與生理鹽水組比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。3.2.2清開靈注射液和生脈注射液3.2.3類過敏反應(yīng)比較脈絡(luò)寧和喜炎平在臨床劑量和2倍臨床劑量時,均評定為類過敏反應(yīng)陽性,藥物組與生理鹽水組比較,有顯著性差異(P<0.01)。見表4。3.3大鼠皮膚過敏鹽酸川芎嗪在臨床劑量和2倍臨床劑量時,評定為類過敏反應(yīng)陰性。見表5。4類過敏反應(yīng)的發(fā)生情況類過敏反應(yīng)不同于過敏反應(yīng),是由非免疫途徑激活機體產(chǎn)生免疫反應(yīng),首次用藥即可表現(xiàn)出典型的速發(fā)性變態(tài)反應(yīng)癥狀。就癥狀表現(xiàn)而言,類過敏反應(yīng)與過敏反應(yīng)高度相似,臨床上難于區(qū)分,常發(fā)現(xiàn)有將二者混淆評判的現(xiàn)象。為了鑒別類過敏反應(yīng),本課題組對大鼠皮膚類過敏試驗方法進行了系統(tǒng)的方法學(xué)研究。與大鼠被動皮膚過敏試驗(PCA)比較,兩者在發(fā)生過程方面不盡相同。PCA是將致敏動物的血清(內(nèi)含豐富的IgE)注射于正常動物皮內(nèi),血清中的IgE與局部皮膚肥大細胞的Fc受體結(jié)合,使之被動致敏,當(dāng)抗原攻擊時,引起局部肥大細胞釋放過敏介質(zhì);而大鼠皮膚類過敏試驗是將類過敏物質(zhì)注入動物皮內(nèi),直接刺激肥大細胞脫顆粒釋放組胺等活性物質(zhì)。但兩者在效應(yīng)上有其共同之處,即肥大細胞脫顆粒釋放的活性物質(zhì)導(dǎo)致血管通透性增高,伊文思藍隨血漿白蛋白滲出至注射部位使之藍染。通過測定藍斑大小,可以檢測血管通透性變化及其程度,進而分析和評判藥物類過敏反應(yīng)的發(fā)生情況。造影劑是臨床上出現(xiàn)較早且被公認的可引起類過敏反應(yīng)發(fā)生的藥物,其導(dǎo)致的類過敏反應(yīng)并不是通過IgE而是通過補體旁路或直接作用于肥大細胞或嗜堿性粒細胞釋放介質(zhì)所致。造影劑在臨床上出現(xiàn)類過敏反應(yīng)非常常見,對那些必需造影但對其有不良反應(yīng)的病人,在造影前須使用皮質(zhì)類固醇及抗組胺劑。本實驗選用臨床上常用的3種造影劑進行評價,結(jié)果碘海醇和泛影葡胺類過敏反應(yīng)陽性,碘普羅胺類過敏反應(yīng)陰性。近年來,中藥注射劑臨床使用出現(xiàn)過敏反應(yīng)的報道不斷增加,經(jīng)分析,其中很大一部分屬類過敏反應(yīng)。為此,本實驗選用大鼠皮膚類過敏試驗方法,對其檢測6種中藥注射劑類過敏反應(yīng)的適用性進行考察。結(jié)果顯示,雙黃連在臨床劑量即可出現(xiàn)類過敏反應(yīng),且為強陽性,此結(jié)果與文獻報道一致;清開靈在臨床劑量和2倍臨床劑量時,均評定為類過敏反應(yīng)陰性,但相對于臨床劑量而言,2倍臨床劑量的藍斑直徑有顯著性增高(P<0.01),提示其有潛在致類過敏性;生脈在臨床劑量和2倍臨床劑量時,評定為類過敏反應(yīng)陽性,且藍斑直徑隨給藥劑量增加而增大,顯示出很強的致類過敏反應(yīng)性;脈絡(luò)寧和喜炎平為國家食品藥品監(jiān)督管理局近期發(fā)布的《藥品不良反應(yīng)信息通報》第48期提示的能引起嚴重過敏反應(yīng)的藥物,課題組對其過敏性進行了全面研究,結(jié)果顯示,脈絡(luò)寧、喜炎平過敏反應(yīng)為陰性,臨床劑量下類過敏反應(yīng)為強陽性,且藍斑直徑隨劑量增加而增大,其癥狀反應(yīng)與通報結(jié)果一致;金納多是直接從銀杏葉中提取精制而成的天然藥物制劑,其臨床反饋結(jié)果相對比較安全,但也有胃腸道不適、惡心、稀便、腹瀉、頭痛、皮膚潮紅、血壓降低等過敏反應(yīng)表現(xiàn)。因此,本研究采用大鼠皮膚類過敏試驗對其進行了致類過敏反應(yīng)的評價。結(jié)果顯示,其在臨床濃度時類過敏反應(yīng)評定為陰性,但高于臨床劑量時,類過敏反應(yīng)評定為陽性。本實驗還選用了注射用化學(xué)合成藥鹽酸川芎嗪,對大鼠皮膚類過敏試驗的適用性進行考察。結(jié)果顯示,在臨床劑量和高于臨床劑量時,其藍斑直徑均小于0.5cm,評定為類過敏反應(yīng)陰性。本實驗以藍斑直徑大于0.5cm作為類過敏反應(yīng)陽性的標準,評定了受試藥的類過敏反應(yīng)情況,經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn),藍斑直徑大小的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果與本試驗的評定結(jié)果有較好的一致性,且隨給藥劑量的增大,藍斑直徑相應(yīng)增大,提示在臨床用藥過程中必須嚴格按照說明書推薦的劑量和靜滴速度用藥,以確保安全。綜上,通過采用大鼠皮膚類過敏試驗對常用的造影劑、中藥注射劑以及化學(xué)合成藥進行類過敏檢測,發(fā)