細(xì)菌的主要耐藥機(jī)制

細(xì)菌的主要耐藥機(jī)制細(xì)菌的主要耐藥機(jī)制1.產(chǎn)生滅活抗生素的各種酶p—內(nèi)酰胺酶（6-lactamase）P一內(nèi)酰胺類抗生素都共同具有一個(gè)核心6—內(nèi)酰胺環(huán)，其基本作用機(jī)制是與細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。產(chǎn)生p一內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對p-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。細(xì)菌產(chǎn)生的p-內(nèi)酰胺酶，可借助其分子中的絲氨酸活性位點(diǎn)，與p一內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)合并打開p一內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致藥物失活。迄今為止報(bào)道的P一內(nèi)酰胺酶已超過300種，1995年Bush等將其分為四型：第1型為不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶；第2型為能被克拉維酸抑制的p-內(nèi)酰胺酶；第3型為不被所有p一內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制的金屬p-內(nèi)酰胺酶（需Zn2+活化）?？杀灰叶匪囊宜岷蚉-chloromercuribenzate所抑制；第4型為不被克拉維酸抑制的青霉素酶。臨床常見的p一內(nèi)酰胺酶有超廣譜p一內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶（AmpC酶）和金屬酶。超廣譜p-內(nèi)酰胺酶（Extended-Spectrump-lactamases,ESBLs）ESBLs是一類能夠水解青霉素類、頭孢菌素類及單環(huán)類抗生素的p一內(nèi)酰胺酶，屬Bush分型中的2型p一內(nèi)酰胺酶，其活性能被某些p一內(nèi)酰胺酶抑制劑（棒酸、舒巴坦、他唑巴坦）所抑制。ESBLs主要由普通p-內(nèi)酰胺酶基因（TEM—1，TEM—2和SHV—1等）突變而來，其耐藥性多由質(zhì)粒介導(dǎo)。自1983年在德國首次發(fā)現(xiàn)ESBLs以來，目前已報(bào)道的TEM類ESBIs已有90多種，SHV類ESBLs多于25種。TEM型和SHV型ESBLs主要發(fā)現(xiàn)于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，亦發(fā)現(xiàn)于變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和其他腸桿菌科細(xì)菌。國內(nèi)近年來隨著三代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs菌的檢出率逐年增加。NCCLs規(guī)定，凡臨床分離的大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌均應(yīng)監(jiān)測是否為產(chǎn)ESBLs菌株；若產(chǎn)生，無論體外對第三代頭抱菌素、氨曲南的藥敏結(jié)果如何，均應(yīng)報(bào)告對三代頭孢菌素及氨曲南耐藥。另外，ESBLs菌株不僅對p-內(nèi)酰胺類抗生素有很高的耐藥率，而且對氨基糖苷類、哇喏酮類耐藥率也在60%左右，因此，臨床遇到由ESBLs引起的感染時(shí)，建議首選含p一內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方抗生素制劑或亞胺培南；對于頭孢毗肟等四代頭孢，尚有爭議，根據(jù)抗菌藥的PK/PD理論，適當(dāng)改變給藥劑量和給藥間隔。以使血藥濃度超過細(xì)菌MIC的時(shí)間達(dá)40%給藥間隔以上，或許是有效的。1.1.2頭孢菌素酶（AmpC酶）屆Bush分類中的1型（I型）p一內(nèi)酰胺酶。通常將其分為由染色體介導(dǎo)產(chǎn)生的AmpCp—內(nèi)酰胺酶和由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的AmpCP一內(nèi)酰胺酶，前者的產(chǎn)生菌有陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌等，后者主要由肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌產(chǎn)生。AmpC酶可作用于大多數(shù)青霉素，第一、二、三代頭孢菌素和單環(huán)類抗生素。而第四代頭孢菌素、碳青霉烯類不受該酶作用。該酶不能被P一內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。AmpCP一內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生有2種可能：①在誘導(dǎo)劑存在時(shí)暫時(shí)高水平產(chǎn)生，當(dāng)誘導(dǎo)劑不存在時(shí)，酶產(chǎn)量隨之下降，三代頭孢菌素、棒酸和碳青霉烯類抗生素是誘導(dǎo)型AmpC酶的強(qiáng)誘導(dǎo)劑；②染色體上控制酶表達(dá)的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致AmpC酶持續(xù)穩(wěn)定高水平表達(dá)。由高產(chǎn)AmpC酶耐藥菌引起的感染死亡率很高。實(shí)際上，所有的革蘭氏陰性菌都能產(chǎn)生染色體介導(dǎo)的AmpC頭孢菌素酶，在多數(shù)情況下為低水平表達(dá)；在腸桿菌、檸檬酸桿菌、沙雷氏菌、銅綠假單胞菌中可高頻誘導(dǎo)產(chǎn)生，且常為高產(chǎn)突變株。當(dāng)臨床出現(xiàn)上述細(xì)菌感染，開始幾天三代頭孢菌素治療敏感，而隨后發(fā)生耐藥時(shí)，我們可懷疑為高產(chǎn)AmpC酶的細(xì)菌感染，四代頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素不受具影響，可供臨床選用。含酶抑制劑的復(fù)方制劑不能用于治療產(chǎn)AmpC酶菌株的感染。1.1.3金屬酶(metallo。-lactamase)大部分6-內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)是絲氨酸殘基，但也有一小部分活性位點(diǎn)為金屬離子的酶類。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的以金屬離子為活性中心的酶是由蠟樣芽抱桿菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶，能被EDTA所抑制，之后世界各地均發(fā)現(xiàn)了能產(chǎn)生這類酶的各種細(xì)菌。1988年Bush首次將該酶定名為金屬6-內(nèi)酰胺酶(metallo。-1actamase)，簡稱金屬酶。金屬6-內(nèi)酰胺酶耐受6—內(nèi)酰胺酶抑制劑且可水解幾乎所有6—內(nèi)酰胺類抗生素(包括亞胺培南)。該酶已在氣單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌中發(fā)現(xiàn)，其中嗜麥芽窄食單胞菌的亞胺培南耐藥性由染色體介導(dǎo)，而脆弱擬桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的突變株在日本已有報(bào)道。由粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的金屬6—內(nèi)酰胺酶IMP-1型可在類似接合子的intl3上移動，已經(jīng)傳播到銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)堿桿菌。金屬酶可以水解碳青霉烯類和最近開發(fā)的第四代頭孢菌素。金屬6-內(nèi)酰胺酶有廣泛傳播的潛力，對幾乎所有的6—內(nèi)酰胺類抗生素均具有水解活性，是目前所知的最強(qiáng)的6-內(nèi)酰胺酶-。1.2.氨基糖甙修飾酶(或鈍化酶/滅活酶)在細(xì)菌對氨基糖甙類抗生素產(chǎn)生耐藥的機(jī)制中，修飾酶介導(dǎo)的耐藥最為流行，酶促修飾的氨基糖甙類抗生素不能與核糖體靶位作用，因此失去抗菌活性。修飾酶主要包括乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶。三類氨基糖苷修飾酶的作用機(jī)制各不相同：乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)修飾依賴于乙酰輔酶A的N-乙?；毫姿徂D(zhuǎn)移酶(APH)修飾依賴于ATP的。-磷酸化；核苷酸轉(zhuǎn)移酶(ANT)修飾依賴于ATP的腺苷化。在革蘭氏陰性病原菌中，最常見的氨基糖苷修飾酶是AAC(6’),使氨基糖苷類抗生素1—、3—、2’一或6'一位乙酰化，如今已發(fā)現(xiàn)16種編碼AAC(6’)的基因。銅綠假單胞菌和腸桿菌科細(xì)菌趨向于產(chǎn)生AAC(3)、AAC(6’)、ANT(2’’)以及APH(3’)；葡萄球菌和糞腸球菌經(jīng)常產(chǎn)生ANT(4’)(4’’)或雙功能的AAC(6’)/APH(2”)。葡萄球菌對慶大霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐藥性和腸球菌的高度慶大霉素耐藥性通常由雙功能酶介導(dǎo)，這些酶通常(但非總是)由位于多重耐藥質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座子(Tn924)編碼，如葡萄球菌具有的轉(zhuǎn)座子Tn5405編碼的APH(3’)(提供卡那霉素、新霉素和阿米卡星耐藥性)，而其他的定位于染色體。越來越多的菌株可產(chǎn)生2種或更多種酶，對抗氨基糖苷類抗生素。在過去幾年里常見的組合是慶大霉素修飾酶ANT(2’’)和AAC(3)］與AAC(6’)結(jié)合，導(dǎo)致對慶大霉素、妥布霉素、耐替米星、卡那霉素和阿米卡星的廣譜耐藥性。氨基糖苷類抗生素對非發(fā)酵菌、腸桿菌科及一些革蘭氏陽性球菌均有很好的抗菌活性，與6—內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用有協(xié)同抗菌作用，在感染治療中占有重要地位。但由于以上耐藥機(jī)制的存在，細(xì)菌耐藥問題也日趨嚴(yán)重，應(yīng)該引起重視，可喜的是阿米卡星等對MRSA和產(chǎn)ESBLs菌株仍保持17%-40%的敏感率。2改變藥物作用靶位2.1青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變導(dǎo)致的6—內(nèi)酰胺類抗生素耐藥青霉素結(jié)合蛋白(PBP)參與了肽聚糖合成的最后階段。高分子量PBP常常為多模塊，具有N末端糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)和C末端轉(zhuǎn)肽酶區(qū)。轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的活性位點(diǎn)絲氨酸與酶的天然結(jié)構(gòu)相仿，可與與6—內(nèi)酰胺類抗生素發(fā)生不可逆?；?。青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變常導(dǎo)致如下兩種臨床重要的耐藥表型。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusarueus,MRSA)MRSA是20世紀(jì)60年代英國首先報(bào)道的一種嚴(yán)重的臨床耐藥致病菌,20世紀(jì)80年代以來，世界各地都相繼發(fā)生MRSA醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，并逐年增多。MRSA耐藥分為固有耐藥和獲得性耐藥，固有耐藥是由染色體介導(dǎo)的，其耐藥性的產(chǎn)生是因?yàn)榧?xì)菌產(chǎn)生一種特殊的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a(或PBP2’)，分子量為78000的蛋白質(zhì)，與6內(nèi)酰胺類抗生素的親和力減低，從而導(dǎo)致細(xì)菌對6-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。PBP2a由mecA基因編碼，95%以上的MRSA菌株能檢測到mecA基因，而敏感株則無。獲得性耐藥是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，細(xì)菌獲得耐藥基因后，產(chǎn)生大量6-內(nèi)酰胺酶(而不是PBPs)，使耐酶青霉素緩慢失活，表現(xiàn)出耐藥性，多為臨界耐藥。在MRSA檢測過程中，凡屬M(fèi)RSA，不管其對其他6-內(nèi)酰胺類抗生素MIC值或抑菌圈的大小，實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)向臨床報(bào)告為對所有青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、碳頭孢烯類和6內(nèi)酰胺類一酶抑制劑復(fù)合制劑耐藥，以免誤導(dǎo)臨床用藥。MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關(guān)鍵是其對許多抗生素具有多重耐藥性，萬古霉素是目前臨床上治療MRSA療效肯定的抗生素，應(yīng)用30多年來未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。新藥替考拉寧亦具有與萬古霉素相似的抗MRSA的活性。耐青霉素肺炎鏈球菌（PenicillinresistantStreptococcuspneumoniae,PRSP）長期以來肺炎鏈球菌對青霉素高度敏感。MIC在0.005-0.01mg/L之間。1967年澳大利亞首次報(bào)道耐青霉素肺炎鏈球菌,MIC為0.5mg/L，此后世界許多國家和地區(qū)均有報(bào)道，且耐藥率迅速上升。PRSP的耐藥機(jī)制肺炎鏈球菌的青霉素結(jié)合蛋白（PBP）發(fā)生改變，使其與青霉素的親和力減低。肺炎鏈球菌有6種PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最為重要，如果青霉素結(jié)合到PBP2b上并使之抑制即導(dǎo)致細(xì)菌溶解和死亡；反之，PBP2b發(fā)生突變，青霉素不能產(chǎn)生作用，則導(dǎo)致PRSP。在PRSP高耐菌株中（MICN2Ug/m1）可有多達(dá)4種PBP（主要是1a、1b、2x、2b）同時(shí)發(fā)生改變［7］。肺炎鏈球菌是引起社區(qū)獲得性肺炎的重要致病菌。目前，國內(nèi)PRSP的發(fā)生率在4%左右，明顯低于歐洲國家，在亞洲也屬于中等水平，且MIC多小于1mg/L，因此，在社區(qū)獲得性肺部感染病原菌中，PRSP尚不構(gòu)成嚴(yán)重威脅，青霉素仍可作為首選治療藥物。但是耐藥沒有國界，中國日前PRSP發(fā)生率尚低.但決不意味著不要重視，而是應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)PRSP的耐藥監(jiān)測。對于PRSP感染臨床治療推薦使用頭孢噻肟/頭孢曲松、新哇諾酮類（如司帕沙星）。若屬PRSP嚴(yán)重感染則需應(yīng)用萬古霉素或加用利福平。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變引起哇諾酮類抗生素耐藥哇諾酮類藥物的作用機(jī)制主要是通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶而抑制DNA的合成，從而發(fā)揮抑菌和殺菌作用。細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有I、II、III、W，哇諾酮類藥物的主要作用靶位是拓?fù)洚悩?gòu)酶II和拓?fù)洚悩?gòu)酶W。拓?fù)洚悩?gòu)酶II又稱DNA促旋酶，參與DNA超螺旋的形成，拓?fù)洚悩?gòu)酶W則參與細(xì)菌子代染色質(zhì)分配到子代細(xì)菌中。革蘭氏陰性菌中DNA促旋酶是哇諾酮類的第一靶位，而革蘭氏陽性菌中拓?fù)洚悩?gòu)酶W是第一靶位。當(dāng)編碼組成DNA促旋酶的A亞單位和B亞單位及組成拓?fù)洚悩?gòu)酶W的parC和parE亞單位中任一亞基的基因發(fā)生突變均可引起哇諾酮類的耐藥性。在所有的突變型中，以gyrA的突變?yōu)橹?，?0%左右，其次是gyrB、parC和parE突變。在所有這些突變類型中，若II型拓?fù)洚悩?gòu)酶上存在2個(gè)突變點(diǎn)（如gyrA和parC上），它們引起對氟哇諾酮類的耐藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于只有一個(gè)突變點(diǎn)（如gyrA或gyrB上)，前者是后者的3-4倍。同時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)突變僅出現(xiàn)在parC基因這一現(xiàn)象。這可能是因?yàn)镈NA促旋酶是氟哇諾酮類的重要靶位,gyrA亞單位的改變可引起酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化致空間位障，阻止哇諾酮類進(jìn)入哇諾酮類作用區(qū)，或引起物理化學(xué)變化，干擾哇諾酮與酶的相互作用。這些結(jié)果顯示gyrA上突變的出現(xiàn)是引起細(xì)菌對哇諾酮類發(fā)生耐藥的主要機(jī)制，而parC突變只是進(jìn)一步引起銅綠假單胞菌對哇諾酮的高度耐藥。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變是細(xì)菌耐哇諾酮類抗菌藥的主要機(jī)制，其他耐哇諾酮類的機(jī)制還包括后面將要談到的細(xì)菌膜通透性改變和主動外排機(jī)制。3細(xì)胞膜透性屏障和抗生素主動外排泵細(xì)菌可以通過細(xì)胞壁的障礙或細(xì)胞膜通透性的改變，形成一道有效屏障，使得抗生素?zé)o法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并達(dá)到作用靶位而發(fā)揮抗菌效能，這也是細(xì)菌在進(jìn)化與繁殖過程中形成的一種防衛(wèi)機(jī)制。這類耐藥機(jī)制是非特異性的，主要見于革蘭氏陰性菌。因?yàn)楦锾m氏陰性菌細(xì)胞壁粘肽層外面存在著類脂雙層組成的外膜，外層為脂多糖，由緊密排列的碳氮分子組成，阻礙了疏水性抗菌藥進(jìn)入菌體內(nèi)。另外細(xì)菌外膜上還存在著多種孔蛋白，分子較大者為OmpF，分子較小者為OmpC，它們可形成特異性通道(OprD)和非特異性的通道(OprF)，作為營養(yǎng)物質(zhì)和親水性抗菌藥物的通道。抗菌藥物分子越大，所帶負(fù)電荷越多，疏水性越強(qiáng)，則不易通過細(xì)菌外膜。細(xì)菌發(fā)生突變失去某種特異孔蛋白后即可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，另外由于外膜蛋白OprF的缺失，使藥物不易通過而產(chǎn)生耐藥性。如銅綠假單胞菌特異性孔蛋白OprD2缺失即導(dǎo)致碳青霉烯類抗生素耐藥。另外一種導(dǎo)致細(xì)菌非特異性耐藥的機(jī)制是細(xì)菌主動外排泵的存在，可以將進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的藥物泵出膜外，從而逃避抗生素的作用。主動外排系統(tǒng)由于能特異地將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多種抗菌藥物主動泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞獲得耐藥性。如大腸埃希氏菌中的多藥外排泵AcorAB-TolC系統(tǒng)可以導(dǎo)致細(xì)菌對包括四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、。一內(nèi)酰胺類、利福平、氟哇諾酮類、氧化劑、有機(jī)溶劑、堿性染料等多種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的藥物耐藥。銅綠假單