細胞貼壁原理

細胞貼壁道理之楊若古蘭創(chuàng)作懸浮細胞：細胞生長不依附撐持物概況，在培養(yǎng)液中呈懸浮形態(tài)生長，這類細胞稱為懸浮細胞.如淋巴細胞.貼壁細胞：在動物細胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的撐持物概況，其依附本身分泌或培養(yǎng)基中的貼附因子才干在該概況生長增殖的離體動物的培養(yǎng)細胞.兼性貼壁細胞：有些細胞其實不嚴酷地依附撐持物，它們既可以貼附于撐持物概況生長，但在必定條件下，它們還可以在培養(yǎng)基中呈懸浮形態(tài)良好地生長，這類細胞稱之為兼性貼壁細胞.貼壁細胞分為，上皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型，在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并耽誤成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其它形狀，而且晃動培養(yǎng)液時，細胞不動.懸浮細胞漂在培養(yǎng)液中，呈圓形，晃動培養(yǎng)液時細胞也隨著漂動貼壁生長的細胞跟懸浮的細胞都有很多種.活體體內(nèi)的細胞當(dāng)離體置于體外培養(yǎng)時大多數(shù)均以貼壁方式生長，次要包含正常細胞和腫瘤細胞，比方成纖維細胞，骨骼組織（骨及軟骨），心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚神經(jīng)膠質(zhì)細胞，內(nèi)分泌細胞，黑色素細胞及各種腫瘤細胞等.少數(shù)細胞在體外培養(yǎng)是懸浮生長，包含一些取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細胞，特別是血液白細胞和淋巴細胞.體外培養(yǎng)貼壁細胞次要的生長特點有：貼附和伸展和接觸按捺和生長的密度限制.貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點.雖然血細胞如淋巴細胞在活體體內(nèi)并沒有聚集的傾向并在體外可于懸浮形態(tài)中生長，但是大多數(shù)的哺乳動物細胞在體內(nèi)和體外均附著于必定的底物而生長，在體外時這些底物可所以其他細胞、膠原、玻璃或塑料等.培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前普通均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細胞將逐步伸展而構(gòu)成必定的形狀，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等.細胞附著于底物時并不是一種須要能量的過程，普通認為與電荷有關(guān).據(jù)材料記載，37°C時在2min內(nèi)細胞之間即可構(gòu)成鍵，該鍵可對0.01%胰蛋白酶起感化且僅發(fā)生于細胞之間，而細胞與底物之間則無；8min后才有波動的鍵構(gòu)成.一些特殊的促細胞附著的物資（如層粘連蛋白、纖維鏈接蛋白、III型膠原、血清擴展因子等）可能介入細胞的貼附過程.這些促細胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于培養(yǎng)液特別血清當(dāng)中.在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細胞再與已吸附有促貼附物

資的底物附著，當(dāng)前細胞將伸展成其本來的形狀..普通來說，從底物離開上去的貼附生長型細胞，不克不及持久在懸浮中生長而將逐步退變，除非這是一些轉(zhuǎn)化了的細胞或惡性腫瘤細胞.另外，經(jīng)過無血清馴化后的細胞，會從貼壁生長轉(zhuǎn)到懸浮生長，目前在生物工程制藥領(lǐng)域，趨勢是使用無血清的懸浮培養(yǎng)為主.體外培養(yǎng)細胞次要的生長特點有：貼附和伸展和接觸按捺和生長的密度限制.貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點.雖然血細胞如淋巴細胞在活體體內(nèi)并沒有聚集的傾向并在體外可于懸浮形態(tài)中生長，但是大多數(shù)的哺乳動物細胞在體內(nèi)和體外均附著于必定的底物而生長，在體外時這些底物可所以其他細胞、膠原、玻璃或塑料等.培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前普通均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細胞將逐步伸展而構(gòu)成必定的形狀，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等.細胞附著于底物時并不是一種須要能量的過程，普通認為與電荷有關(guān).據(jù)材料記載，37°C時在2min內(nèi)細胞之間即可構(gòu)成鍵，該鍵可對0.01%胰蛋白酶起感化且僅發(fā)成于細胞之間，而細胞與底物之間則無；8min后才有波動的鍵構(gòu)成.一些特殊的促細胞附著的物資（如層粘連蛋白、纖維鏈接蛋白、III型膠原、血清擴展因子等）可能介入細胞的貼附過程.這些促細胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于細胞膜概況

或培養(yǎng)液特別血清當(dāng)中.在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細胞再與已吸附有促貼附物資的底物附著，當(dāng)前細胞將伸展成其本來的形狀.普通來說，從底物離開上去的貼附生長型細胞，不克不及持久在懸浮中生長而將逐步退變，除非這是一些轉(zhuǎn)化了的細胞或惡性腫瘤細胞. 摘自司徒鎮(zhèn)強主編的細胞培養(yǎng)一書，具體內(nèi)容見1.2培養(yǎng)細胞的特性1、細胞貼壁道理培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前普通均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細胞將逐步伸展而構(gòu)成必定的形狀，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等.細胞附著于底物時并不是一種須要能量的過程，普通認為與電荷有關(guān).據(jù)材料記載，37°C時在2min內(nèi)細胞之間即可構(gòu)成鍵，該鍵可對0.01%胰蛋白酶起感化且僅發(fā)現(xiàn)于細胞之間，而細胞與底物之間則無；8min后才有波動的鍵構(gòu)成.一些特殊的促細胞附著的物資（如層粘連蛋白、纖維鏈接蛋白、III型膠原、血清擴展因子等）可能介入細胞的貼附過程.這些促細胞附著因子（或貼壁因子）均為蛋白質(zhì)，存在于細胞膜概況或培養(yǎng)液特別血清當(dāng)中.在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細胞再與已吸附有促貼附物資的底物附著，當(dāng)前細胞

將伸展成其本來的形狀.普通來說，從底物離開上去的貼附生長型細胞，不克不及持久在懸浮中生長而將逐步退變，除非這是一些轉(zhuǎn)化了的細胞或惡性腫瘤細胞.另外，經(jīng)過無血清馴化后的細胞，會從貼壁生長轉(zhuǎn)到懸浮生長，目前在生物工程制藥領(lǐng)域，趨勢是使用無血清的懸浮培養(yǎng)為主.2、 貼壁細胞如何分離上去？如果把貼壁的細胞洗上去最經(jīng)常使用的法子就是加入胰蛋白酶消化，37°C環(huán)境下放置3?5min即可，但是殘留培養(yǎng)瓶內(nèi)的胰蛋白酶對細胞有毒性感化，所以都會添加低濃度的血清以中和胰蛋白酶的.用超聲的法子也能夠把細胞分離上去，但是要留意超聲的頻率不克不及太大，而且細胞很嬌嫩，超聲會導(dǎo)致細胞的破裂.這是由細胞的性質(zhì)特點決定的.3、 是否所有動物細胞都要貼壁生長？有些細胞是必必要附著在撐持物上才可以生長的，比方肝細胞，胃上皮細胞等等而有些細胞可以懸浮生長，比方骨髓細胞白，血病細胞等等這些細胞的生長都是須要添加血清的，而不是有些人說的，加入血清后會貼壁.體外培養(yǎng)細胞次要的生長特點：貼附和伸展和接觸按捺和生長的密度限制.提高羊水細胞培養(yǎng)成功率的方法來自：生物01丁082007-09-2719:43:46摘要:目的提高羊水培養(yǎng)的成功率.方法正常羊水保存換液標本，以備復(fù)查;異常羊水采取細胞分離技術(shù)提取羊水中的無效細胞成分;及時發(fā)現(xiàn)凈化羊水并進行抗菌處理.結(jié)果提高了羊水培養(yǎng)的成功率(99-4%)并縮短異常羊水的培養(yǎng)時間，解決了部分凈化羊水的凈化成績(2/3).結(jié)論保存換液標本可無效解決因收集不當(dāng)而導(dǎo)致沒法診斷的成績;細胞分離技術(shù)可提高異常羊水細胞培養(yǎng)的成功率并縮短培養(yǎng)時間,凈化的羊水也可抗菌后培養(yǎng)成功.羊水細胞培養(yǎng)因為技術(shù)請求高、難度大、周期長、易凈化、分裂相較少、對人員素質(zhì)請求高等成績而難以普及，但是羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備與核型分析是產(chǎn)前診斷染色體病的次要手段.多年來對羊水細胞的培養(yǎng)及其染色體制片雖不竭有所改進,但羊水細胞培養(yǎng)與制片的難度仍沒有絲毫降低[1,7].近年鼓起的基因診斷因為特異性強、設(shè)備請求高、監(jiān)測范圍窄、實驗影響身分多等缺陷仍沒法取代羊水細胞培養(yǎng)與核型分析在產(chǎn)前診斷中的價值與地位.幾年來，我們針對血性羊水、胎糞、胎脂凈化及細菌凈化等嚴重影響羊水培養(yǎng)的成功成績進行了一些探索，并取得了比較滿意的后果,現(xiàn)陳述如下.材料與方法試劑與器材一次性無菌離心管和50ml的培養(yǎng)瓶是美國Fancon公司生產(chǎn)的，羊水培養(yǎng)基為美IrvineScientific公司生產(chǎn)ChangMediumC公用羊水培養(yǎng)基,。。2培養(yǎng)箱為FORMAL3131.倒置顯微鏡為OLYMPUSCKX-41.對象經(jīng)產(chǎn)前篩查評估結(jié)果為高風(fēng)險發(fā)病率的妊婦或有其它產(chǎn)前診斷指征、孕周在16~27w的妊婦.羊水收集方法B超定位后，慣例消毒，采取22號PIE穿刺針穿刺，最初用5ml打針器抽取約2ml羊水棄去,再換一20ml打針器抽取羊水約20m,l注入兩個1次性的無菌離心管中，標本盡快送實驗室接種.普通羊水的處理方法正常的羊水與輕度血性羊水以1200?1300rpm離心10min，棄去上清液，保存0.5ml羊水，輕輕混懸細胞，以備接種用.嚴重血性羊水的處理以1200~1300rpm離心10min后，將上清液移入另1無菌離心管中，保存約1ml羊水并混勻，另取1離心管加入約2ml無菌淋巴細胞分離液，再將混勻的羊水細胞懸液1?2ml緩緩加入淋巴細胞分離液的上層，請求分層清晰，以1200?1300rpm離心10min后,液體分4層:自下而上順次為紅細胞、分離液、羊水細胞、羊水.汲取中層薄薄的一層羊水細胞于1離心管頂用首次分離出來的羊水上清液洗濯分離出來的羊水細胞2~3次，以除去混入的細胞分離液，最初留下0.5ml羊水,輕輕混懸細胞，以備接種用.嚴重胎糞、胎脂凈化的羊水也可用此細胞分離方法提純羊水細胞.6.羊水細胞培養(yǎng)與制片將羊水細胞用無菌滴管打勻，接種于50ml塑料培養(yǎng)瓶中，并加入ChangMediumC培養(yǎng)液4m，l用滴管輕輕混勻，蓋上瓶蓋，切勿擰緊，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).到第5天若觀察到有較好的梭形細胞克隆則更換新穎培養(yǎng)液.將本來的培養(yǎng)液及混懸的羊水細胞轉(zhuǎn)入一個備用的無菌小瓶中，封蓋仍放入5%CO2培養(yǎng)箱中.收獲時在培養(yǎng)終止前4h加入秋水仙素，終極濃度為2.0mg/ml?2.5mg/ml.羊水細胞的收獲、制片、顯帶等操縱同傳統(tǒng)的方法.如若收獲失敗，制片中沒有可用于分析的染色體核型,則將備用小瓶中的羊水細胞從頭分離接種入細胞培養(yǎng)瓶中并加入新穎的培養(yǎng)液4m，l后面的步調(diào)同新接種的羊水細胞培養(yǎng)步調(diào)一樣.7.凈化羊水的處理羊水細胞接種后，前兩天每天觀察1~2次,以便觀察是否有凈化，若無凈化，則不再觀察，若有凈化的證據(jù)應(yīng)立即加入廣譜抗生素（如阿莫西林或氨芐西林）,濃度為10^g/ml~15^g/m,l加入12h后，觀察抗菌后果,如果有抗菌后果則再加入1次抗生素,如果抗菌后果不明顯，再加入另一種抗生素（如頭抱曲松）15略/皿1?20pg/ml.每24h加入1次，普通不超出3次（抗生素在體外代謝較慢，藥物濃度有累加后果），待有細胞貼壁時馬上更換新穎的培養(yǎng)液，并加入10pg/m1?15pg/m1的廣譜抗生素.結(jié)果1.總共338例羊水標本一次性培養(yǎng)成功率達到99.4%（2例失?。?325例普通羊水收獲時間平均為7.8d,最早的?45?中國優(yōu)生與遺傳雜志2007年第15卷第6期在第一次換液（第5天）即可收獲，最長的為16d.2.9例嚴重血性羊水均培養(yǎng)成功，前3例未經(jīng)過處理培養(yǎng)周期為15?33d，經(jīng)過細胞提純處理的后6例羊水培養(yǎng)收獲時間為7?18d，處理后的羊水貼壁時間明顯提前.4例微生物凈化的羊水1例未作任何處理，培養(yǎng)失敗;另3例發(fā)現(xiàn)凈化后立即加入廣譜抗生素，1例因發(fā)現(xiàn)較晚培養(yǎng)失敗,2例培養(yǎng)成功,收獲時間分別為13d、18d.4.收獲的336例羊水細胞，每例制備6~8張染色體玻片，229例可獲15個以上可分析的核型;另有7例收獲制片后，沒法進行核型分析,又將備用瓶中的羊水細胞從頭接種,2次或3次培養(yǎng)、收獲、制片成功.討論影響羊水細胞培養(yǎng)成功率的身分很多[2,6],但次要的是培養(yǎng)基的質(zhì)量和羊水中存活細胞的數(shù)量.我們利用了多種品牌的羊水培養(yǎng)基，認為美國IrvineScientific公司生產(chǎn)的ChangMediumC公用羊水培養(yǎng)基后果較好，細胞貼壁時間早，生長快.對17?27w的羊水培養(yǎng)情況進行分析后，認為羊水的最好收集時間為18?24w之間.18w之前羊水中細胞比較少，貼壁細胞克隆少，收獲較晚;25w以后的羊水有構(gòu)成分增多，常較混濁，因為有構(gòu)成分較多（包含大量的死細胞），嚴重地影響了活細胞的貼壁，是以也形成收獲時間耽誤.孕周大的羊水一旦發(fā)現(xiàn)幾個貼壁克隆時就應(yīng)及時換液,清除大量有構(gòu)成分對貼壁細胞生長的影響.孕周越大,死細胞越多、雜質(zhì)越多、活細胞越少，細胞貼壁越困難.羊水收集時機的掌控是能否制得良好染色體核型玻片的關(guān)鍵[3].細胞克隆多、面積大、透亮細胞多時可收獲較多的分裂相.實踐中我們觀察到:類圓形細胞克隆收獲的分裂相最好，梭長形羊水細胞克隆收獲時分裂相易受細胞數(shù)量的影響.這可能與類圓形細胞貼壁可能不是很緊,易收獲、低滲后果好、滴片時細胞易破碎有關(guān)而梭長形羊水細胞克隆貼壁緊、不容易因低滲腫脹、滴片時細胞不容易破裂，是以核型分散后果絕對較差.所以要彌補梭長形羊水細胞克隆的這一缺點，就必必要有較多的貼壁細胞和透亮細胞.如果細胞克隆較少且生長的細胞數(shù)較少，應(yīng)及時進行傳代[3],以便獲得較多的細胞克隆，否則一個細胞克隆時間過長細胞生長的速度就會變慢，分裂絕對減少.對嚴重血性羊水來說，因為混入了大量的紅細胞，嚴重的影響了成活羊水細胞的貼壁[4],同時羊水中混入的血漿也容易使羊水凝集，慣例分離獲得的羊水細胞中除混有大量的紅細胞外,還混有纖維蛋白絲等，這些成分對細胞的生長也有按捺感化;大量的紅細胞不但嚴重影響羊水細胞的貼壁而且在羊水培養(yǎng)的過程中紅細胞會不竭的破壞，釋放的血紅素對羊水細胞也有必定的毒性感化.我們通過細胞分離技術(shù),提純羊水細胞，清除了紅細胞對羊水細胞貼壁的影響，清除了纖維蛋白及其降解產(chǎn)品對細胞生長的影響，清除了血紅素對羊水細胞的毒性感化,使血性羊水的收獲時間明顯提前.從羊水收集到收獲的過程比較復(fù)雜漫長，其中的任何一個環(huán)節(jié)都有可能對羊水或培養(yǎng)物形成凈化[5,6,7],我們在日常工作中必定要嚴酷操縱規(guī)程,留意無菌操縱.同時緊密觀察，一旦發(fā)現(xiàn)有凈化景象應(yīng)及時采納措施,首要的方法是加入抗生素.我們在發(fā)現(xiàn)羊水有凈化時加入抗生素，及時的搶救了部分凈化標本，減少了病人的痛苦，提高了實驗技能.因為抗生素在抗菌的同時也會按捺羊水細胞的生長,是以加入抗生素的量和品種必定要合適.我們目前利用的抗生素的量也只是一個探索用量，最好抗生素用量還有待于進一步探索.解決羊水微生物凈化的關(guān)鍵還是嚴酷無菌操縱程序.綜上所述，采取合格的培養(yǎng)基、備份式的羊水細胞收獲、血性羊水的細胞純化及在凈化羊水細胞培養(yǎng)瓶中加入合適的抗生素等可以添加羊水細胞的貼壁幾率、縮短羊水細胞培養(yǎng)時間、提高羊水細胞培養(yǎng)的成功率,具有次要的臨床意義和實際利用價值.參考文獻周煥庚，夏家輝,張思仲，主編.人類染色體[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1987.劉曉翌,肖曉素,樊尚榮，等.羊水細胞染色體制備方法的研討[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志,2004,5(4):296-300.鄭育紅，孫筱放，孫小蔓.原瓶傳代培養(yǎng)利用于羊水產(chǎn)前診斷中的研討[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2002,1(6):58-59.許爭峰，胡婭莉,朱瑞芳.高效羊水細胞培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的利用J].中華婦產(chǎn)科雜志,2006,41(4):275.SeguinLR,PalmerCG.Variableinf1uencinggrowthandmorphologyandcoloniesofcellsfromhumanamnioticfluid[J].PrenatDiagn,1983,3:110.TurhanN0,ErenU,SeckinNC.Second-trimestergeneticamniocente-si