芒果苷對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用

芒果昔對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用糖尿病性心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)是由于糖尿病狀態(tài)下糖、脂代謝紊亂導致心肌、血管內(nèi)皮等組織的代謝紊亂，引起心肌肥大、變性、增厚、間質(zhì)纖維化，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一［1］。近年來越來越多的學者發(fā)現(xiàn)，心肌間質(zhì)纖維化在DCM的發(fā)生和發(fā)展中起著不容忽視的作用。因此，如何預(yù)防和治療糖尿病心肌纖維化已成為目前國際上研究的熱點之一。AP-1是一種致纖維化因子，在心臟疾病中的作用已逐漸受到人們的關(guān)注。它是由原癌基因jun和fos分別編碼的JUN和FOS蛋白嵌合而成的二聚體復(fù)合物，能結(jié)合于DNA上誘導細胞增殖或細胞凋亡［2］。它參與了許多生長因子和細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導致機體一系列的生理和病理變化［3］。AP-1也是MAPK信號通路的主要作用底物，MAPK家族中的ERKs、JNKs和p38MAPKs通過不同的底物磷酸化，在基因水平和蛋白水平對AP-1活性進行調(diào)控［4-5］?；罨腁P-1能與DNA調(diào)節(jié)序列相結(jié)合，可被基因啟動子或增強子序列識別并結(jié)合，從而啟動相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄。與AP-1結(jié)合的DNA序列包括TGF-B1、纖維連接蛋白、層粘連蛋白B及纖溶酶原激活抑制物(PAI-1)等基因的啟動子，這些基因的表達均受AP-1調(diào)控［6-8］。Aragno［9］等研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可導致AGEs增加，AGEs和AGE受體結(jié)合后誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量氧自由基，激活A(yù)P-1，進而上調(diào)TGF-Bl。轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowingfactor-B1，TGF-Bl)屬TGF-B超家族，是一種多功能細胞信號分子，調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達，在細胞增殖、分化及細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)分泌等方面有重要調(diào)節(jié)作用。TGF"能在心肌細胞表達，并與心肌纖維化有關(guān)［10］。高血糖可通過激活蛋白激酶C(PKC)途徑直接刺激TGF-B的表達，進而促進成纖維細胞增生、肥大及膠原合成增加。TGF-B在糖尿病心肌病中，由活化型的TGF-B受體介導，并能在ECM和基底膜處與蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮局部生物學作用，其主要作用使成纖維細胞合成膠原纖維、纖維連接蛋白、蛋白多糖增加，促使組織纖維化［11］。纖維連接蛋白(FN)又稱纖連蛋白，分子量440KD。它主要由肝細胞、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、纖維母細胞合成、分泌，能趨化纖維母細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞參與組織增生、修復(fù)、纖維化。纖維連接蛋白(FN)基因啟動子亦有AP-1結(jié)合位點［12］,AP-1的活化可直接促進FN的表達。芒果苷(mangiferin),又名芒果素，知母寧，是從百合科植物知母中提取的天然多酚類化合物。眾多研究表明，芒果苷具有抗氧化［13］、抗病毒、調(diào)節(jié)凋亡、抗腫瘤、抗糖尿?。?4］、抗炎癥等作用。Giron等研究也表明：芒果苷可抑制a-糖苷酶活性，使葡萄糖在肌肉和脂肪細胞中的轉(zhuǎn)換增加更多的進入組織，降低血糖［15］，同時對a-葡萄糖苷酶活性抑制作用良好，使得葡萄糖基無法水解進入血液成為游離葡萄糖。本實驗建立糖尿病大鼠模型，觀察芒果苷對糖尿病大鼠心臟的保護作用以及對AP-1、TGF-B1、FN表達的影響，進而探究芒果苷治療糖尿病心肌病的機制，為臨床干預(yù)糖尿病心肌病提供新的依據(jù)。糖尿病心肌病(DCM)是指糖尿病時心臟微血管病變和心肌代謝紊亂引起的心肌廣泛灶性壞死，可誘發(fā)心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死。臨床早期主要表現(xiàn)為舒張功能不全，晚期也合并收縮功能障礙。糖尿病心肌病大鼠模型鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)是一種從鏈霉菌屬中提取的抗生素，能選擇性地作用于胰島的B細胞，誘導糖尿病的發(fā)生［16］。STZ腹腔或尾靜脈注射是制備糖尿病大鼠模型的常用方法。本實驗尾靜脈注射1%STZ45mg/Kg,72h后，連續(xù)三次隨機血糖N16.7mmol/L為DM模型。飼養(yǎng)12W后，糖尿病模型組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)均明顯升高；LVEDP明顯升高，LVSP、土dp/dtmax顯著降低，提示模型組大鼠心功能已明顯受損。從形態(tài)學上看，HE染色：DM模型組大鼠心肌細胞體積明顯增大，大小不均，胞漿豐富，心肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)炎性細胞浸潤。Masson染色心肌間隙明顯增寬，膠原纖維明顯增多。AP-1/TGF-B1/FN信號通路與糖尿病心肌病活化蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)被譽為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第三信使，啟動基因轉(zhuǎn)錄的分子開關(guān)，其在細胞增殖、分化、凋亡等病理過程中起著樞紐作用。它不僅參與了許多細胞因子的轉(zhuǎn)錄、誘導粘附分子的表達和自身免疫應(yīng)答，還能夠激活基因誘導的自身免疫介導的胰島B細胞凋亡［17］。因而AP-1介導的轉(zhuǎn)錄異常有可能導致1型糖尿病的發(fā)生［18］Jun和Fos基因?qū)σ幌盗写碳O為敏感［19］，這些刺激包括［20］：TPA、血清、細胞因子及T、B淋巴細胞激活蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)和紫外線照射、電離輻射、DNA損傷、氧化應(yīng)激等，受刺激后迅速被活化，Jun和Fos蛋白的表達顯著增加。糖尿病時糖代謝紊亂，大量的ROS產(chǎn)生。活化的ROS可激活PKC和MAPK，進而使轉(zhuǎn)錄因子AP-1發(fā)生磷酸化后而被激活［21］?；罨腁P-1能與TGF-B1結(jié)合，促進TGF-B1的表達，進而使心肌纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-B1的基因啟動子中含有兩個AP-1的結(jié)合位點（位于-453至-323之間），其中任何一個突變或應(yīng)用AP-1特異性抑制劑姜黃素均能阻斷高糖誘導的TGF-B1的表達。這提示TGF-B1基因轉(zhuǎn)錄為AP-1依賴性的［22］。Weigert等［23］發(fā)現(xiàn)，低分子肝素可抑制TGF-B1上的AP-1結(jié)合位點，從而阻斷了高糖誘導的TGF-B1的表達。TGF-B1是一種強效致纖維化因子，其表達升高與多種原因引起的纖維化密切相關(guān)，是纖維化形成最重要的作用因子之一。研究［24］發(fā)現(xiàn)TGF-B1是DC發(fā)展過程中重要的致病因子，能夠促使心肌細胞肥大，促進細胞外基質(zhì)的合成增加，進而對心肌組織產(chǎn)生損害。另外，活化的TGF-B1可抑制蛋白水解酶和間質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達，抑制纖溶酶原、膠原酶、基質(zhì)酶酶原激活物的產(chǎn)生，誘導蛋白水解酶抑制物的合成，從而使ECM降解，最終使ECM在細胞間沉積［25］。劉曉健等［26］研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌組織TGF-B1的表達明顯增強、心肌纖維間微血管基底膜顯著增厚且突向管腔，血管基底膜增厚導致血管功能紊亂，說明TGF-B1的強表達參與了糖尿病心肌病變的發(fā)生與發(fā)展。TGTokudome等［27］將心肌成纖維細胞置于高糖溶液中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖能增TGF-B1mRNA表達，加速膠原合成，并且膠原增加程度與TGF-31mRNA水平增加一致。高糖［28］可通過TGF-31介導使FNmRNA表達上調(diào)，F(xiàn)N表達明顯升高。纖維連接蛋白（FN）是一類具有多種生物學功能的大分子糖蛋白，廣泛存在于細胞表面、結(jié)締組織基質(zhì)及體液中。FN是細胞外基質(zhì)的主要成分之一，它是最早出現(xiàn)在損傷組織中的基質(zhì)蛋白成分，常被用作評價基質(zhì)積聚程度的指標。FN是構(gòu)成間質(zhì)的主要糖蛋白，存在于心肌ECM中，就像心肌細胞與基質(zhì)膠原之間的一座橋梁［29］。在病理過程中它可以促使成纖維細胞增生并產(chǎn)生更多的ECM，而增多的FN又在各種生長因子的作用下，引起細胞肥大和纖維細胞增生，這個過程持續(xù)發(fā)展，ECM不成比例的過度積聚，膠原含量增加，最終導致纖維化。本實驗中，與正常對照組相比，糖尿病模型組AP-1、TGF-31、FN的表達增加顯著，這與國內(nèi)外相關(guān)研究一致，同時提示AP-1/TGF-31/FN信號通路可能參與了糖尿病心肌損傷。三、芒果苷對糖尿病心肌的保護作用芒果苷是一種強氧化劑，不但可以清除氧自由基，還可抑制氧自由基的生成［30］。芒果昔能夠阻止十四酰佛波醇醋酸鹽醋（TPA）即所引發(fā)的大鼠肝臟、大腦氧化損傷及腹膜巨噬細胞活性氧（ROS）的產(chǎn)生，還能減少TPA誘發(fā)誘發(fā)的DNA片段的形成。研究表明，芒果苷對H2O2引起的小鼠紅細胞的氧化損傷有保護作用，可以抑制紅細胞氧化溶血和膜蛋白降級，進而保護由于H2O2引起的紅細胞膜的改變［31］。Muruganandan等［32］采用環(huán)磷酰胺誘導成年雄性大鼠免疫毒性，發(fā)現(xiàn)芒果苷能明顯降低細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)及靶器官的重量，可增強淋巴細胞、多形核細胞、巨噬細胞中脂質(zhì)過氧化作用，降低過氧化氫酶和血清肌酸磷酸激酶的活性，進而改善環(huán)磷酰胺導致的組織損傷。Prabhu［33］研究芒果苷能使心臟組織抗氧化酶如SOD，過氧化氫酶，谷胱甘肽還原酶的活性和非酶抗氧化劑等的活性顯著上升，提高對抗心肌防御系統(tǒng)損傷的敏感性。本研究顯示，與糖尿病模型組相比，芒果苷各劑量組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)、LVEDP均降低，LVSP、土dp/dtmax升高，心肌病理改變均減輕，且以芒果苷高劑量組改善最為顯著，說明芒果苷對糖尿病心肌具有保護作用；與；糖尿病模型組相比，芒果苷各劑量組AP-1、TGF-B1、FN的表達均降低，且呈劑量依賴性，提示芒果苷可能通過抑制AP-1/TGF-B1/FN信號通路，進而改善糖尿病心肌病損。綜上所述，芒果苷對糖尿病心肌組織具有保護作用，其機制可能為抑制AP-1的表達，進而下調(diào)TGF-B1、FN，減少膠原纖維沉積，但具體機制有待進一步的探究。糖尿病心肌病的研究新進展1972年，Ruber等人根據(jù)4個成年糖尿病患者在無明顯的冠狀動脈及瓣膜病變、先天性心臟病、高血壓及酗酒的情況下患充血性心衰（CHF）首次提出糖尿病心肌的概念［1］。糖尿病心肌病變是由糖尿病狀態(tài)所導致的一種心臟疾病，與血管及瓣膜病理改變無關(guān)，早期表現(xiàn)為無癥狀的舒張功能障礙，最終將發(fā)展為有癥狀的充血性心衰，心室順應(yīng)性下降，收縮功能受損［2］。糖尿病使發(fā)生充血性心衰的危險性增加2.5?5.0倍，除了糖尿病常伴有的CHF傳統(tǒng)的危險因素如肥胖、高血壓、冠脈病變外，糖尿病心肌病變發(fā)揮了重要作用［3］。1.DCM的發(fā)病機制1.1心肌細胞的代謝障礙糖尿病患者糖代謝異常和脂代謝異常是加速心肌病變發(fā)生發(fā)展的重要原因。Golfman等［4］報道Zucker糖尿病肥胖大鼠心肌細胞中三酰甘油（TG）積聚，過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR-a）調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平增加，GLUT-4轉(zhuǎn)錄下調(diào)，而使用PPAR-a激動劑可以逆轉(zhuǎn)上述改變。這表明心肌細胞代謝紊亂，脂毒性均參與了糖尿病心肌能量代謝和心功能的改變。糖尿病慢性并發(fā)癥主要由體內(nèi)四種代謝途徑異常所致，即多元醇代謝亢進，蛋白激酶C（PKC）激活，蛋白質(zhì)非酶糖化及起其終產(chǎn)物（AGEs）形成增加，己糖胺途徑活性增高。長期高血糖能促進體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶糖化形成AGEs，心肌中較多糖蛋白和ACEs沉積，導致心肌收縮功能和順應(yīng)性下降，影響和損害組織或器官功能。此外，AGEs還能影響內(nèi)皮細胞一氧化氮（NO）的合成，使冠狀血管的舒張功能受損。高血糖可激活PKC，PKC是參加促使正常心肌轉(zhuǎn)化為DCM的重要途徑之一，有學者認為，其亞型PKC-B還與糖尿病微血管病變或大血管病變的病理改變有關(guān)［5］。目前認為糖代謝異常是DCM發(fā)生的關(guān)鍵始動因素。1.2心肌離子通道異常和電生理改變心肌細胞內(nèi)的Ca是調(diào)節(jié)心肌收縮的重要離子。糖尿病心肌毒性物質(zhì)的聚集會引起心肌亞細胞水平重構(gòu)和鈣的超負荷，其機制包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca-三磷酸苷酶活性下降，心肌肌漿網(wǎng)Ca-ATP酶攝取Ca能力下降以及Na-Ca交換和肌漿Ca泵能力減低［6］。糖尿病心肌肌鈣蛋白I磷酸化導致心肌Ca對心肌調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)敏感性下降。Belke等研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca-三磷酸苷酶和鈣泵蛋白減少是導致左室收縮功能不全的原因。細胞膜上參與動作電位復(fù)極的鉀外流降低和鈣通道水平上升是直接導致心肌細胞動作電位周期延長及胞內(nèi)鈣超載的主要因素。Qin等［7］用RNA酶保護分析法和Western印跡研究糖尿病大鼠左心室心肌K通.道基因表達和分布密度，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠在發(fā)病早期就存在K通道Kv2.1,Kv4.2和Kv4.3明顯減少,K內(nèi)流抑制，由此引起動作電位時程延長，復(fù)極滯緩等心肌電生理異常，從而導致惡性心率失常和猝死的發(fā)生.。1.3氧化應(yīng)激的作用氧化應(yīng)激主要是由心肌抗氧化能力受損及活性氧族過度產(chǎn)生的兩個機制構(gòu)成：：相關(guān)實驗證明［8］，鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠心臟中抗氧化和抗凋亡蛋白下調(diào)，谷胱甘肽、尿酸氧化物的利用度下降，導致心臟抗氧化防御能力降低。生理情況下，活性氧族主要由線粒體產(chǎn)生，而在糖尿病時活性氧族可通過脂質(zhì)代謝、葡萄糖自身氧化等多種途徑產(chǎn)生。煙酰胺嘌吟二核苷酸磷酸氧化酶活性降低和黃嘌吟氧化還原酶活性增加均可促進活性氧族產(chǎn)生。活性氧族可影響多種線粒體蛋白的活性，使ATP生成減少而發(fā)生細胞功能障礙，降低細胞中還原性谷胱甘肽水平及還原性谷胱甘肽水平/氧化型谷胱甘肽比例，從而損害細胞膜的完整性，增加細胞膜的通透性，使血管基底膜增厚，導致微血管病變。氧化應(yīng)激損心臟后可通過激活核糖聚合酶來修復(fù)損傷［9］。而核糖聚合酶的過度激活和細胞內(nèi)煙酰胺嘌吟二核苷酸氧化態(tài)進一步消耗，導致氧化還原失衡，細胞內(nèi)氧化狀態(tài)更加惡化。1.4心肌細胞凋亡心肌細胞有不可再生的特點，在糖尿病心肌病變過程中有心肌細胞凋亡的發(fā)生，并隨心臟功能的降低呈加速趨勢。長期心肌收縮單位的喪失將會加速心衰的形