rp-hplc法測(cè)定人血漿中氫氯噻嗪的濃度

rp-hplc法測(cè)定人血漿中氫氯噻嗪的濃度

氫氯仿是一種含有氯仿的利尿劑。它影響腎小管對(duì)電解質(zhì)的重吸收機(jī)制,直接增加鈉和氯離子的等量排泄,造成體內(nèi)Na+、水負(fù)平衡使細(xì)胞外液減少和血容量減少。既而增加血漿腎素的活性、醛固酮的分泌,致尿中鉀離子的流失,降低血鉀從而治療高血壓。本文建立了一種快速測(cè)定人血漿中氫氯噻嗪濃度的方法。1儀器、試劑和儀器HPLC系統(tǒng):島津LC-10ADVP雙泵,島津SPD-10AVP檢測(cè)器,島津DGU-14A脫氣儀,天津奧特賽斯AT-330柱溫箱,7125手動(dòng)進(jìn)樣閥,浙江大學(xué)N2000色譜工作站,SANTAX不間斷電源。梅特勒320pH計(jì);IECCENTRA-7R冷凍離心機(jī);梅特勒AE電子分析天平;Finnpipette200,1000μL連續(xù)可調(diào)節(jié)加樣器;Cole-Parmer4721-00型多管渦旋器。氫氯噻嗪對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)氫氟噻嗪對(duì)照品購(gòu)自SIGMA公司(USP標(biāo)準(zhǔn));乙腈、甲基叔丁基醚均為HPLC級(jí),美國(guó)TEDIA公司生產(chǎn);磷酸鈉,分析純,上海試劑二廠;四甲基氯化銨,分析純,上海試劑一廠;磷酸,分析純,杭州建德化工廠;氫氧化鈉,分析純,蕭山化學(xué)試劑廠。2enexc38預(yù)柱的結(jié)構(gòu)色譜柱為島津Shim-packVP-ODS色譜柱(5μm,150mm×4.6mm),PhenomenexC18預(yù)柱(4mm×3.0mm);流動(dòng)相:水-乙腈(85∶15),水相為pH=4.90的緩沖溶液(四甲基氯化銨4.8g、磷酸鈉3.6g溶于1800mL去離子水中,以磷酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.90),流速為1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)271nm,柱溫30℃,靈敏度為0.01AUFS。3溶液的制備3.1配制0.0.0%ml-1的儲(chǔ)備液精密稱(chēng)取氫氯噻嗪對(duì)照品0.2500g,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25mL量瓶,用甲醇定容至刻度,得濃度為10mg·mL-1的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量,配制成濃度分別為100,10,1.0,0.5,0.1μg·mL-1的對(duì)照品溶液。3.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱(chēng)取氫氟噻嗪對(duì)照品適量,加甲醇溶解定容,制成2mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,取此儲(chǔ)備液適量,用甲醇配制成濃度為2,4μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。4方法和結(jié)果4.1有機(jī)約化劑為5%聚甲基苯磺酸鹽緩沖液dsc-ms在10mL玻璃試管中加入4μg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液25μL,N2吹干。將冷凍血漿置于室溫條件下使其融化,渦旋20s混勻,精密吸取0.5mL置于上述玻璃試管中,渦旋20s,加入甲基叔丁基醚5mL,渦旋2min,3000r·min-1離心5min,吸取上層有機(jī)相約4mL置5mL玻璃樣品瓶中,40℃水浴下N2吹干。加入200μL流動(dòng)相重組,取50μL進(jìn)樣。4.2血樣的線性回歸分析t取氫氯噻嗪對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液適量,N2吹干,依次加入500μL空白血漿制成濃度分別為2,5,50,100,200,300,400ng·mL-1的對(duì)照品血漿各5份按“4.1”項(xiàng)下方法操作,以氫氯噻嗪峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)氫氟噻嗪峰面積的比值(Y)對(duì)氫氯噻嗪濃度(X)用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重因子1/X)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=5.142×10-3X-0.0019r=0.9991結(jié)果表明,在2.0～400.0ng·mL-1濃度范圍內(nèi)峰面積比與氫氯噻嗪血漿濃度呈良好的線性關(guān)系,最低定量濃度(S/N=10)為2.0ng·mL-1。4.3平均加收率和rsd在同一天內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)不同濃度氫氯噻嗪對(duì)照品血漿各5份進(jìn)行分析測(cè)定,結(jié)果表明,測(cè)定方法的日內(nèi)平均回收率94.1%～109.0%,RSD均小于10%,結(jié)果見(jiàn)表1;連續(xù)5d對(duì)5,100,300ng·mL-1氫氟噻嗪對(duì)照品血漿各5份進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,測(cè)定方法的日間平均回收率為100.3%,108.8%,103.0%,RSD均小于6%,結(jié)果見(jiàn)表1。4.4提取回收率試驗(yàn)用空白血漿精密配制濃度分別為為5,100,300ng·mL-1的對(duì)照品血漿(n=5),按“4.1”項(xiàng)下方法處理,另取空白血漿按“4.1”項(xiàng)下方法處理,N2吹干前加入和配制對(duì)照品血漿相同的氫氯噻嗪對(duì)照品溶液,計(jì)錄氫氯噻嗪的峰面積,兩者比值即為氫氯噻嗪的提取回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。4.5溶液穩(wěn)定性測(cè)定配制濃度分別為5,100,300ng·mL-1的對(duì)照品血漿各12份,置于-20℃低溫冰箱內(nèi)冷凍保存,在30d內(nèi)不同時(shí)間(0,10,20,30d)分別取樣3份,按“4.1”項(xiàng)下方法操作,計(jì)算濃度,3種不同濃度的對(duì)照品血漿在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得值的RSD分別為7.6%,4.3%,6.9%,說(shuō)明氫氯噻嗪血漿在-20℃條件下放置30d穩(wěn)定。4.6對(duì)照品血漿中氫氯噻嗪-內(nèi)標(biāo)溶液的制備取空白血漿500μL,按血漿樣品預(yù)處理方法處理,得空白血漿色譜圖1-A;取一定濃度的氫氯噻嗪溶液適量和內(nèi)標(biāo)溶液,加入人空白血漿中得100ng·mL-1對(duì)照品血漿,同法操作得對(duì)照色譜圖1-B;取用藥后人血漿處理得樣品色譜圖1-C。圖示1號(hào)峰為氫氮噻嗪,2號(hào)峰為內(nèi)標(biāo)氫氟噻嗪。結(jié)果表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及同服的藥物對(duì)氫氯噻嗪的測(cè)定均無(wú)明顯干擾。5藥動(dòng)學(xué)參數(shù)擬合本研究經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),9名健康志愿者在簽署知情同意書(shū)后分3次交叉口服氫氯噻嗪片6.25,25,50mg,給藥前及給藥后0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12,18,24,36,48,72h取靜脈血約4mL,離心取血漿冷凍保存待測(cè)。采用3P97程序擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù),見(jiàn)表2。9名受試對(duì)象的平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2,結(jié)果顯示氫氯噻嗪在人體的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程較好地符合開(kāi)放的二室模型,且在服藥劑量范圍內(nèi)氫氯噻嗪在人體呈現(xiàn)線性代謝的特征。6化合物離子法氫氯噻嗪分子結(jié)構(gòu)中含有磺?；?由于其吸電子效應(yīng),使氫氯噻嗪具有一定的酸性。曾嘗試用離子抑制來(lái)分