自生固氮菌的分離鑒定

自生固氮菌的分離鑒定楊從發(fā)1,王淑軍1,陳靜1,許興友2(1.淮海工學(xué)院食品工程系，江蘇連云港，222005)

(2.淮海工學(xué)院化學(xué)工程系，江蘇連云港，222005)淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，8(2)摘要：從非豆科作物根際土壤中分離篩選得到213個(gè)在無氮培養(yǎng)基上能良好生長的菌株，通過酶活測(cè)定，從中篩選得到18株固氮能力較強(qiáng)的菌株，并對(duì)其中酶活最高的4株菌株進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。利用它們可望制成適合于不同農(nóng)作物生長的生物復(fù)合肥。關(guān)鍵詞：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料0引言微生物肥料的一些作用和生態(tài)效益是化學(xué)肥料所不具備的［1］，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺激作物生長和抑制有害微生物的活動(dòng)，從而達(dá)到增產(chǎn)的目的⑵。此外，生產(chǎn)微生物肥料投資少，可利用農(nóng)副產(chǎn)品就地取材。因而，微生物肥料的生產(chǎn)吸引了許多研究者的興趣。本文報(bào)道從水稻、小麥、玉米和蔬菜等非豆科作物根際土壤中分離得到18株固氮能力較高的自生固氮菌，并對(duì)其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株進(jìn)行了分類鑒定，結(jié)果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。1材料和方法1.1菌種采集水稻、小麥、玉米和蔬菜等農(nóng)作物的根際土壤土樣56個(gè)，從中分離獲得213株在無氮培養(yǎng)基上能良好生長的菌株。1.2分離培養(yǎng)基及分離方法1.2.1富集培養(yǎng)基蔗糖15g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，碳酸鈣1g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鉬酸鈉、硼酸、硫酸錳、硫酸亞鐵(現(xiàn)配)水溶液各1mL，水1000mL，pH為6.5?7.0，在250mL三角瓶中，每瓶分裝30mL，滅菌備用。1.2.2富集培養(yǎng)方法取3?5g土樣用50mL水制成混濁液，吸取5mL懸浮液裝入盛有30mL富集培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，100rpm，28^，培養(yǎng)3?5天后，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)4?5次后，稀釋分離。1.2.3平板分離培養(yǎng)基在富集培養(yǎng)基中加入2%瓊脂制成平板分離培養(yǎng)基，滅菌后，倒入無菌培養(yǎng)皿中備用。1.2.4分離方法取富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，稀釋涂布平板分離培養(yǎng)基°28°C培養(yǎng)2天后，將在稀釋度較大的平板上，生長較大的菌落移入斜面。培養(yǎng)后，保藏備用。1.3固氮酶活性測(cè)定1.3.1氣相色譜法參考文獻(xiàn)［3］的方法，略加改變，將2mL乙炔氣體沖入試管斜面內(nèi)，塞上無菌橡皮塞，28C，培養(yǎng)24h后，用氣相色譜儀測(cè)量固氮酶的活性，每種取4?5個(gè)重復(fù)，進(jìn)樣量100ML，按以下公式進(jìn)行計(jì)算酶活。EA7=(58.0XSeXTXPe)/(SbXTeXPXt)(以mol/h(斜面))Se：乙烯峰面積;T：開氏絕對(duì)溫度(T=273.13K)Pe:實(shí)驗(yàn)條件下的大氣壓強(qiáng)(Pa);Sb：乙炔峰面積;Te：實(shí)驗(yàn)條件下的溫度(K);P：絕對(duì)大氣壓強(qiáng)(P=101324.72Pa);t=培養(yǎng)時(shí)間(t=24h)

1.3.2微量凱氏定氮法囹 用以下公式計(jì)算含氮量:EA2=((V1-V2)X14X1000)/V(mg/L)V1：樣品滴定時(shí)用去的0.01N標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液毫升數(shù)；V2：空白滴定時(shí)用去的0.01N標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液毫升數(shù)；14：是1個(gè)毫克當(dāng)量氮的毫克數(shù)；V：發(fā)酵液樣品毫升數(shù)。2結(jié)果和討論2.1分離結(jié)果從非豆科作物根際土壤中分離得到213個(gè)菌株，用氣相色譜法和微量凱氏定氮法測(cè)定它們的固氮酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，34株沒有固氮能力(含氮量＜1mg/L),161株有固氮能力(含氮量1?10mg/mL),18株固氮能力較強(qiáng)(含氮量＞10mg/mL),其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌產(chǎn)酶能力最高。表1對(duì)固氮能力較強(qiáng)的18株菌株的酶活測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。表1：固氮酶活力測(cè)定結(jié)果(18株菌株)HQEHQEA2榮株母r.ti「心pmal-'h|/i.pmal-'h|/i.11..1Ml1.1.D14.Ah?i7；板n46.1Hl*1LIn.4.H.n笠..im112.2/i.pmcil/h|Zim155.5任.6121.27Ti斗r ■.14.n30.51DI.2牌.H771647..1.12.7p心撲.4.ID.6表1中,，EAl(“mol/h表1中,，EAl(“mol/h斜面)是用氣相色譜法)EA1=(58.0XSsXTxPe)/(SbXiTeXPXt)U?底U定各菌株的試管斜面的固氮酶活性值。按以下公式計(jì)算:rH4ri45.4Iri.2雖然理論上，在固定條件下，乙快還原活性與固氮酶對(duì)氮?dú)獾墓潭ɑ钚猿收嚓P(guān)，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，會(huì)由于斜面的新鮮程度，斜面培養(yǎng)基中的杲些組成等原因，而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以，每種菌都取5支對(duì)數(shù)生長期的斜面做重復(fù)試驗(yàn)，以盡量減少誤差。EA2(mg/L)是將菌株接種到無氮培養(yǎng)液中，28°C，100rpm培養(yǎng)7天后，用微量凱氏定氮法測(cè)定最終發(fā)酵液的含氮量。按以下公式計(jì)算：EA2=((V1-V2)X14X1000)/V(mg/L)經(jīng)回歸分析［6］，EA1與EA2呈強(qiáng)正直線相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.9527)，回歸方程為EA2=7.9560+0.5016XEA1，其結(jié)果與文獻(xiàn)［3］的有關(guān)報(bào)道相似。2.2鑒定結(jié)果2.2.1形態(tài)特征 見表2所示。表2形態(tài)特征垠.咨

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