基因操作習(xí)題和答案

第一章一.名詞解釋：1.Genemanipulation基因操作。將在細(xì)胞外產(chǎn)生的核酸（物質(zhì)）分子插入到病毒，質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中，再整合到特定的宿主中，從而形成一種新的可持續(xù)繁殖的有機(jī)體。2.Interruptedgenes間斷基因。序列中間插入有與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)，使一種基因分隔成不持續(xù)的若干區(qū)段。我們稱這種編碼序列不持續(xù)的基由于間斷基因。3.Promotor啟動子。DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開始的部位。4.Subcloning亞克隆。當(dāng)時(shí)始克隆中的外源DNA片段較長，具有許多目的基因以外的DNA片段時(shí)，在諸如體現(xiàn)、序列分析和突變等操作中不便進(jìn)行，將目的基因所對應(yīng)的一小段DNA找出來，這個(gè)過程叫“亞克隆”。二.填空題1.基因操作（Genemanipulation）的關(guān)鍵部分是基因克?。╣enecloning），genecloning的基本要點(diǎn)有（），（）和（）。參照答案：克隆基因的類型；受體的選擇；載體的選擇2.（）是遺傳物質(zhì)的基本單位,也是作為遺傳物質(zhì)的核酸分子上的一段片段。它可以是持續(xù)的，也可以是（）；可以是（），也可以是RNA；可以存在于染色體上，也可以（）。參照答案：基因；不持續(xù)的；DNA；存在于染色體之外（如質(zhì)粒，噬菌體等）3.基因操作并不是一種法律概念，除了包括基因克隆外，還包括基因的（）、（）、（）和（）等與基因研究有關(guān)的內(nèi)容。參照答案：體現(xiàn)；調(diào)控；檢測；改造4.啟動子（Promotor）是指（）。一般一種Gene與否體現(xiàn)，（）是關(guān)鍵的一步，是起決定作用的。在轉(zhuǎn)錄過程中，Promoter還是（）的結(jié)合位點(diǎn)。參照答案：基因轉(zhuǎn)錄過程中控制起始的部位；轉(zhuǎn)錄起始；RNA聚合酶5.原核生物的RNApolymerase重要由兩部分構(gòu)成：（）和（），其中σ-因子并不參與RNA的合成，它的作用重要是（）。關(guān)鍵酶；σ因子；識別要轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)6.從（）到（）的這一段距離稱為一種轉(zhuǎn)錄單位，或者一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中可包括一種或者多種Gene。啟動區(qū)；終止區(qū)7.轉(zhuǎn)錄終止子重要有兩種，一種是（），另一種是（）。依賴ρ因子；不依賴ρ因子8.Gene的書寫方式，一般是寫出的DNA序列總是與（）相似的那條鏈，方向是從（）到（）。對于堿基的位置，一般自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)向兩個(gè)方向編號，其中轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)定為（），（）定為-1。參照答案：mRNA；5'；3'；+1；在起始點(diǎn)上游第一種堿基9.重疊基因（Overlappinggene）是指（），間隔基因（Interruptedgene）是指（）參照答案：一種基因的序列中，單個(gè)DNA序列可編碼一種以上的蛋白質(zhì)；在編碼序列中間插入的一段無編碼作用的堿基序列三.簡答題1.簡述基因克隆的兩個(gè)基本特性？參照答案：基因克隆的兩個(gè)基本特性是一是強(qiáng)調(diào)外源核酸分子（一般狀況下都是DNA）在不一樣宿主中的繁殖，打破自然種的界線未來自于不有關(guān)物種的基因放入一種宿主中是基因操作的一種重要特性，基因操作的另一種重要特性是繁殖。2.談?wù)勀銓ene的認(rèn)識，并簡要說說gene概念的發(fā)展?fàn)顩r？※3.怎樣理解gene及其產(chǎn)物的共線性和非共線性？參照答案：基因決定蛋白質(zhì)的序列構(gòu)成，是由密碼子對應(yīng)特定氨基酸所決定的。當(dāng)一種基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列是一一對應(yīng)時(shí)，則表明它們是共線性的。在原核生物中，基因及其產(chǎn)物是共線性的。70年代以來，在真核生物中，發(fā)現(xiàn)了間斷基因，后來發(fā)現(xiàn)這種間斷基因在真核生物中普遍存在，也就是后來所說的基因間存在著內(nèi)含子。內(nèi)含子指真核生物基因中不能被翻譯成蛋白質(zhì)的DNA片斷，但可被轉(zhuǎn)錄，當(dāng)兩側(cè)序列的轉(zhuǎn)錄RNA被剪接在一起時(shí)，就將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的RNA從整個(gè)轉(zhuǎn)錄物中除去。外顯子是指可以翻譯成蛋白質(zhì)的任一間斷的基因片段，一種基因可有多種外顯子。內(nèi)含子并不是一成不變的，具有相對性，對一種DNA片斷來說，在某個(gè)基因中是內(nèi)含子，但在另一種基因中卻可以作為外顯子。4.什么是genecloning？什么是亞克隆（subcloning）？參照答案：基因克隆：一定程度上等同于基因的分離，即從復(fù)雜的生物體基因組中，通過酶切，消化等環(huán)節(jié)，分離帶有目的基因的DNA片段?；騺喛寺。撼醪娇寺≈械耐庠雌瓮^長，具有許多目的基因片段以外的DNA片段，在諸如體現(xiàn)、序列分析和突變等操作中不便進(jìn)行，因此必須將目的基因所對應(yīng)的一小段DNA找出來，這個(gè)過程叫“亞克隆”。5.假如從一種原核生物中cloning某基因（1-2kb），請談?wù)勊幕经h(huán)節(jié)？參照答案：①對原核生物染色體DNA進(jìn)行不完全酶切，純化所得到的DNA片斷，并與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；②得到轉(zhuǎn)化子后，根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知序列設(shè)計(jì)探針，雜交，篩選轉(zhuǎn)化子；③所得到的轉(zhuǎn)化子中具有目的基因，深入作亞克隆，一步步地向目的基因迫近，最終可得到目的基因6.什么叫基因工程（GeneEngineering），試從理論和技術(shù)兩個(gè)方面談?wù)凣eneEngineering誕生的基礎(chǔ)？參照答案：基因工程（GeneEngineering）又稱基因操作（GeneManipulation）、重組DNA?；蚬こ淌且苑肿舆z傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代措施為手段，將不一樣來源的基因（DNA分子），按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以變化生物原先的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的構(gòu)造和功能。思索題問題：簡述基因操作、基因重組和基因工程的關(guān)系。思索題問題：為何說基因工程是生物學(xué)和遺傳學(xué)發(fā)展的必然產(chǎn)物？思索題問題：簡述基因的構(gòu)造構(gòu)成對基因操作的影響。第二章一.名詞解釋1.Restrictionandmodification限制和修飾。宿主特異性地降解外源遺傳物質(zhì)（DNA）的現(xiàn)象稱為限制。外源遺傳物質(zhì)通過甲基化等作用防止宿主的限制作用稱為修飾。2.Matchedends匹配末端。識別位點(diǎn)為回文對稱構(gòu)造的序列，經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的相似的，互補(bǔ)的末端稱為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend）。3.Bluntends平末端。在回文對稱軸上同步切割DNA的兩條鏈，產(chǎn)生的沒有堿基突出的末端稱為平末端。4.Isoschizomer：同裂酶。識別相似序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)也許不一樣。5.Isocaudiners：同尾酶。來源不一樣、識別序列不一樣，但產(chǎn)生相似粘性末端的酶。6.Sitepreferences：位點(diǎn)偏愛。某些限制酶對同一介質(zhì)中的不一樣位置的同一種識別序列體現(xiàn)出不一樣的切割效率的現(xiàn)象稱為位點(diǎn)偏愛。7.Staractivity星星活性。在極端非原則條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個(gè)變化的特殊性稱星星活性。8.Nickingenzyme切口酶。有些限制酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，這種酶稱為切口酶。9.KlenowfragmentKlenow片段。KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影響。10.Sequenase測序酶。是改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。SequenaseVersion2切除了所有的3'--5'外切活性，用于雙脫氧鏈終止法對長片段進(jìn)行測序。11.Reversetranscriptase反轉(zhuǎn)錄酶。即依賴于RNA的DNA聚合酶，它有5'--3'合成DNA活性，不過無3'--5'外切活性。它來自AMV（禽成髓細(xì)胞瘤病毒）或Mo-MLV（Moloney鼠白血病病毒，又稱M-MuLV）。12.Terminaltransferase末端轉(zhuǎn)移酶。來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細(xì)胞及分化初期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不尋常的DNA聚合酶，在二價(jià)陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3'羥基端。若dNTP為T或C，此二價(jià)陽離子首選鈷離子；若dNTP為A或G，此二價(jià)陽離子首選鎂離子。13.Ligase連接酶。催化DNA5'磷酸基與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵，將兩段核酸連接起來的酶。14.T4polynucleotidekinaseT4多核苷酸激酶。催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5'末端。15.Alkalinephosphatase堿性磷酸酶。重要來源于牛小腸（Calfintestinalalkalinephosphatase），簡稱CIP或CIAP，也有來自細(xì)菌（BAP）。催化除去DNA或RNA5'磷酸。16.S1nucleaseSl核酸酶。來源于米曲霉（Aspergillusoryzae），可降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5'磷酸的單核苷酸或寡核苷酸雙鏈；對dsDNA，dsRNA，DNA:RNA雜交體不敏感。17.ExonuleaseЩ外切核酸酶Щ。來源于大腸桿菌，催化從dsDNA3'-OH逐一清除單核苷酸的反應(yīng)，底物為dsDNA或線狀和帶切口或缺口的環(huán)狀DNA，反應(yīng)成果是在dsDNA上產(chǎn)生長的單鏈區(qū)。18.Singlestrandbindingprotein單鏈結(jié)合蛋白。此蛋白能協(xié)同地與ssDNA結(jié)合而不與dsDNA結(jié)合，可以減弱鏈內(nèi)二級構(gòu)造的穩(wěn)定性，從而加速互補(bǔ)多核苷酸的重新退火，并通過消除阻礙DNA聚合酶前進(jìn)的鏈內(nèi)二級構(gòu)造，而提高這些聚合酶的持續(xù)作用能力。19.ProteinaseK蛋白酶K是具有高活性的絲氨酸蛋白酶，屬枯草桿菌蛋白酶，可以水解范圍廣泛的肽鍵，尤其適合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之間的肽鍵。K指該蛋白酶通過水解角蛋白（keratin）可認(rèn)為該霉菌提供所有所需的碳源和氮源。20.Lysozymes溶菌酶。一類水解細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的酶，常用的是卵清溶菌酶，用于破碎細(xì)胞。二.填空題1.Ecok的一般分子構(gòu)成為R2M2S，在這些亞基中，R亞基具有（）的作用，M亞基具有（）的作用，S亞基具有（）的作用，當(dāng)該該酶發(fā)生作用時(shí)，需用到的輔因子有：（）、（）、（）。限制酶；甲基化；識別DNA序列；ATP；SAM；Mg2+2.限制性內(nèi)切核酸酶（Restrictionendonuclease）的命名是按屬名和種名相結(jié)合的原則的，一般第一種大寫字母取自（），第二、三個(gè)字母取自（），第四個(gè)字母則用（）表達(dá)。參照答案：屬名的第一種字母；種名的前兩個(gè)字母；菌株名3.Ⅱ型限制酶識別回文對稱序列，在回文序列（）或（）切割DNA，產(chǎn)生帶3'－OH和5'－P基團(tuán)的DNA的產(chǎn)物，需（）的存在才能發(fā)揮活性，對應(yīng)的修飾酶只需SAM。參照答案：內(nèi)部；附近；Mg2＋4.從因特網(wǎng)上可以找到限制酶的數(shù)據(jù)庫（），該網(wǎng)站由NewEnglandBiolabs企業(yè)維護(hù)（）。REBASE5.識別相似序列的限制酶稱（）同裂酶6.Ⅰ-CeuI酶是衣滴蟲葉綠體大rRNA基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識別位點(diǎn)為（）bp，識別的關(guān)鍵部位為（）至（）位置的19bp，反應(yīng)溫度為37℃7.位點(diǎn)偏愛是指：（）限制酶對不一樣位置的同一種識別序列體現(xiàn)出不一樣的切割效率8.1單位NaeⅠ或NarⅠ的定義：（）參照答案：切割1μg腺病毒2DNA在50ul體系中1小時(shí)所需的酶量9.有些限制酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，即（）切口酶10.個(gè)體間DNA限制性片段長度的差異叫（）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）11.DNA載體經(jīng)HindⅢ切割后產(chǎn)生粘性末端，能發(fā)生載體自連，影響載體與外源DNA的連接效率，常用的防止載體自連的措施有（）、（）。去磷酸化；部分補(bǔ)平12.完全的回文序列應(yīng)具有兩個(gè)特點(diǎn)即（）和（）。參照答案：可以在中間劃一種對稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對稱互補(bǔ)配對；兩條互補(bǔ)鏈的5'--3'的序列構(gòu)成相似，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180°，則兩條鏈重疊13.DcmMethylase（Dcm甲基化酶）的識別序列為（）和（），該酶的作用位點(diǎn)為（）。CCTGG；CCAGG；第二個(gè)胞嘧啶C的C5位置填空題問題：大腸桿菌中至少有三種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)（）、（）、（）。它們識別的序列各不相似，但只識別通過甲基化的序列，都限制CpG甲基化酶作用的DNA。mcrA；mcrBC；mrr14.分別寫出如下限制性內(nèi)切核酸酶（Restrictionendonuclease）的識別序列EcoRⅠ（）、Sau3AⅠ（）、HindⅢ（）。GAATTC；GATC；AAGCTT15.Weiss單位的定義為（）參照答案：在37℃下20分鐘內(nèi)催化1nmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β16.限制性內(nèi)切核酸酶（Restrictionendonuclease）一般保留在（）濃度的甘油溶液中。50%17.載體和外源DNA經(jīng)酶切，在進(jìn)行下一步操作前，需消除限制性內(nèi)切核酸酶（Restrictionendonuclease）的影響。常用的措施有（）、（）、（）、（）。參照答案：EDTA法；加熱法；苯酚抽提法；試劑盒除酶法18.對DNA進(jìn)行雙酶切時(shí)，酶切緩沖液的選擇原則有(1)（）、(2)（）、(3)（）參照答案：可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液；若緩沖液不可替代則先用低濃度的，再加適量NaCl和第二種酶；先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液19.DnaseⅠ為內(nèi)切核酸酶，在不一樣的輔因子條件下，產(chǎn)生不一樣的酶切效果，當(dāng)Mg2+存在時(shí)（）；當(dāng)Mn2+存在時(shí)（）。參照答案：獨(dú)立作用于每條DNA鏈，且切割位點(diǎn)隨機(jī)；可在兩條鏈的大體同一位置切割dsDNA，產(chǎn)生平端或1到2個(gè)核甘酸突出的DNA片斷20.KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase經(jīng)蛋白酶裂解而從全酶中除去（）活性的多肽大片斷，而其他活性保持不變。5'--3'的外切活性T4phageDNApolymerase分子量為（）kDa，該酶的3'--5'的外切活性比Klenow酶強(qiáng)（）倍，由于它不從單鏈DNA模板上替代引物，故可用于（）。114；200；提高誘變反應(yīng)21.反轉(zhuǎn)錄酶來自AMV或Mo－MLV，即依賴于RNA的DNA聚合酶，它有（）活性，但無（）活性。5'--3'合成DNA的；3'--5'的外切22.末端轉(zhuǎn)移酶來源于（），是存在于前淋巴細(xì)胞及分化初期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不尋常的DNA聚合酶，在（）存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3'羥基端。小牛胸腺；Mg2＋23.T4DNA連接酶的分子量為68kDa，它可以催化DNA5'磷酸基與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵。反應(yīng)底物為粘端、切口、平端的RNA或DNA。低濃度（）和（）可以提高平端連接效率。聚乙二醇PEG；單價(jià)陽離子24.E.coliDNA連接酶與T4DNA連接酶相似，但需（）的參與，且其平端連接效率低常用于置換合成法。煙酰胺－腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）T4多核苷酸激酶在高濃度的ATP時(shí)發(fā)揮最佳活性，（）是其強(qiáng)烈克制劑。NH4＋25.BAL31核酸酶重要活性為3'外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3'端清除掉單核苷酸；還可從內(nèi)部切割核酸，作用于單鏈。BAL31發(fā)生作用依賴（），（）可克制其活性。Ca2＋；EGTA26.綠豆核酸酶來源于綠豆芽，與S1酶相似，但比S1酶更溫和，在（）上才切割，可使DNA突出端變成平端。大切口27.核糖核酸酶A來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異襲擊（）?？沙NA:RNA中未雜交的RNA區(qū)，可用來確定DNA或RNA中單堿基突變的位置。RNA上嘧啶殘基的3'端28.用于構(gòu)建嵌套缺失體常用到的核酸酶有（）、（）、（）。DnaseⅠ；外切核酸酶Ⅲ；BAL3129.瓊脂糖酶作用于低熔點(diǎn)瓊脂糖，它的活性是可切割瓊脂糖酶亞單位。由于此酶可分解瓊脂糖，因此應(yīng)用于（）。分離大片段DNA三.選擇題1.限制性內(nèi)切酶一般保留在（）濃度的甘油溶液中。C50%點(diǎn)評：合適濃度的甘油和二甲基亞砜可以作為冰凍保護(hù)劑，保護(hù)生物大分子的活性。2.限制性圖譜與限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）圖譜的最明顯區(qū)別在于（）參照答案：A前者是物理圖譜后者是連鎖圖點(diǎn)評：詳細(xì)理解兩者的概念3.迄今為止所發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶可以作用于（）只能作用于雙鏈DNA點(diǎn)評：限制性內(nèi)切核酸酶的識別和切割序列有很強(qiáng)的特異性，尤其是第Ⅱ型的限制性內(nèi)切酶。4.已知某一內(nèi)切酶在一種環(huán)狀DNA上有4個(gè)切點(diǎn)，當(dāng)用此酶切割該環(huán)狀DNA，可以得到（4）個(gè)片段點(diǎn)評：注意DNA分子的形狀，其他條件相似的時(shí)候，線狀比環(huán)狀產(chǎn)生的片段要多一種。5.甘油會使許多限制性內(nèi)切核酸酶的特異性發(fā)生變化，是導(dǎo)致某些酶星星活性的重要原因之一，防止的措施是在酶切反應(yīng)體系中，將甘油的濃度控制在（）如下A5%點(diǎn)評：低溫下保留生物大分子時(shí)，甘油可以作為冰凍保護(hù)劑，但反應(yīng)體系中甘油濃度過高會導(dǎo)致星星活性。6.在下列進(jìn)行DNA部分酶切的條件中，控制哪一項(xiàng)最佳（）D酶量點(diǎn)評：多種酶均有適合自己的反應(yīng)溫度；同步根據(jù)酶反應(yīng)動力學(xué)，酶切反應(yīng)一定期間后酶的活性就會減弱或喪失，因此控制酶量是最合適的7.下列試劑中，哪一種可以螯合Ca2＋離子（）DEGTA點(diǎn)評：EDTA螯合Mg2+等金屬離子，EGTA螯合Ca2＋離子。8.DNA被某種酶切割后，電泳得到的電泳帶有些擴(kuò)散，下列原因中，哪一項(xiàng)不太也許（）C酶失活點(diǎn)評：理解限制性內(nèi)切酶酶切本質(zhì)和DNA電泳試驗(yàn)原理。9.nick與gap的區(qū)別在于（）A前者是斷開了一種磷酸二酯鍵，后者是指DNA的單鏈中有較小的缺失10.可以在切口部位起作用的酶是（）BS1核酸酶點(diǎn)評：BAL31核酸酶重要活性為3'外切核酸酶活性，可以從線性DNA兩條鏈的3'端去掉單核苷酸；S1核酸酶可降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5'磷酸的單核苷酸或寡核苷酸，中等濃度可在切口或小缺口處切割雙鏈；核糖核酸酶A可以特異襲擊RNA上的嘧啶殘基的3'端，可除去DNA:RNA中未雜交的RNA區(qū)；λ外切核酸酶可以作用于dsDNA，持續(xù)逐一釋放5’單核苷酸。11.Klenow酶與DNA聚合酶相比，前者喪失了（）活性參照答案：A5'--3'外切酶點(diǎn)評：KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影響。12.限制酶的命名遵照一定的原則，波及來源（宿主），菌株或生物型。命名時(shí)（）參照答案：A屬名第一字母，種名頭兩個(gè)字母，菌株號，然后再加上序號（羅馬字）點(diǎn)評：限制酶的命名遵照一定的原則，波及來源（宿主），菌株或生物型。命名時(shí)，依次取屬名第一字母，種名頭兩個(gè)字母，菌株號，然后再加上序號（羅馬字）如下對同裂酶的描述中，哪一項(xiàng)是對的的（）A識別相似序列的限制酶稱同裂酶點(diǎn)評：識別相似序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)也許不一樣。詳細(xì)可分為：同裂同切酶、同序異切酶、“同功多位”等13.下列DNA聚合酶中，哪一種酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈切口，即切口酶（）ADnaseⅠ點(diǎn)評：在Mg2+存在下，獨(dú)立作用于每條DNA鏈，且切割位點(diǎn)隨機(jī)。在Mn2+存在下，它可在兩條鏈的大體同一位置切割dsDNA，產(chǎn)生平端或1～2個(gè)核苷酸突出的DNA片段；KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影響；T4噬菌體DNA聚合酶與KlenowDNA聚合酶相似，但3'--5'外切活性強(qiáng)200倍，且不從單鏈DNA模板上替代引物；T7噬菌體DNA聚合酶的活性功能與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類似，但3'--5'外切活性為Klenow的1000倍。14.BAP與CIAP的區(qū)別在于（）BCIAP68℃時(shí)失活，而BAP68點(diǎn)評：CIAP來源于牛小腸堿性磷酸酶，而BAP來自細(xì)菌的堿性磷酸酶。BAP抗性強(qiáng)、抗高溫和清除污劑。CIAP可用蛋白酶K消化滅活，或在5mMEDTA下。65℃或75℃處理10分鐘，然后用酚、氯仿抽提，純化去磷酸化的DNA，從而除去CIAP的活性。15.下列哪一種酶作用時(shí)需要引物（）B反轉(zhuǎn)錄酶點(diǎn)評：其他三種酶均只需要DNA鏈即可16.CIAP催化脫磷酸時(shí)有兩種最適溫度，37℃和56點(diǎn)評：3'端突出時(shí)，磷酸基團(tuán)是內(nèi)陷的，需要劇烈一點(diǎn)的反應(yīng)條件。17.有關(guān)宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下述描述中只有（）不恰當(dāng)參照答案：D這一系統(tǒng)的核酸酶都是Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶點(diǎn)評：根據(jù)酶的亞單位構(gòu)成、識別序列的種類和與否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為四類：Ⅱ型、Ⅱs型、Ⅰ型、Ⅲ型18.限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識別（）C雙鏈DNA的特定堿基序列點(diǎn)評：理解限制性內(nèi)切酶的識別序列。19.如下為同尾酶的是（）BBamHⅠ,Sau3AⅠ,StyⅠ點(diǎn)評：所謂同尾酶即他們可以產(chǎn)生相似的粘性突出末端。其中B選項(xiàng)中BamHⅠ識別位點(diǎn)為G↓GATCC，Sau3AⅠ識別位點(diǎn)為↓GATC，StyⅠ識別位點(diǎn)為CC↓WWGG。（W=AorT）在長模板鏈的指導(dǎo)下引物延伸合成長的DNA互補(bǔ)鏈時(shí)應(yīng)選用（）BT7DNA聚合酶點(diǎn)評：T7DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一種20.在大腸桿菌中，大多數(shù)均有三個(gè)位點(diǎn)特異性的DNA甲基化酶，如下選項(xiàng)中哪一種酶不包括在內(nèi)（）DSssⅠ點(diǎn)評：SssⅠ甲基化酶來自原核生物Spiroplasma21.在大腸桿菌中，至少有3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)，如下選項(xiàng)中不屬于這3種的為（）CmcrD點(diǎn)評：無mcrD22.如下幾種核酸酶中，不能用于嵌套缺失的為（）BS1核酸酶點(diǎn)評：S1核酸酶可降解單鏈DNA或RNA，酶濃度大時(shí)可完全消化雙鏈，中等濃度可在切口或小缺口處切割雙鏈。23.下面有關(guān)限制酶的論述哪個(gè)是錯誤的（）A限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶點(diǎn)評：理解限制性內(nèi)切酶的特性。24.在下列酶中，催化反應(yīng)不需要ATP的是（）DBamHⅠ點(diǎn)評：Ⅰ型和Ⅲ型限制性內(nèi)切酶在發(fā)生限制作用時(shí)需要ATP，Ⅱ型則不需要，而BamHⅠ為Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，在催化反應(yīng)時(shí)不需要ATP25.DNA連接酶在體內(nèi)的重要作用是在DNA復(fù)制、修復(fù)中封閉缺口，下列對DNA連接酶的描述中，那項(xiàng)是對的的（）參照答案：A將雙鏈DNA分子中的5'磷酸基團(tuán)同3'－OH末端重新形成磷酸二酯鍵點(diǎn)評：理解DNA連接酶的特性。26.下列酶中，除（）外都具有磷酸酶的活性ABamHⅠ點(diǎn)評：磷酸酶活性包括磷酸化活性和去磷酸化活性。四.簡答題1.簡述限制性內(nèi)切核酸酶（Restrictionendonuclease）的概念及其生物學(xué)功能？參照答案：定義：指識別DNA的特異序列，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。生物學(xué)功能：保護(hù)宿主不受外來DNA分子的感染，可降解外來的DNA分子，從而制止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。2.PCR引物設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)時(shí)，為何需在酶切位點(diǎn)后加上某些堿基？參照答案：限制酶切割DNA時(shí)對識別序列兩端的非識別序列有長度規(guī)定，也就是說在識別序列兩端必須要有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。因此，一般需在設(shè)計(jì)引物時(shí)在限制酶切位點(diǎn)外另加3～4個(gè)堿基。3.試回答影響限制性內(nèi)切核酸酶（Restrictionendonuclease）切割效率的原因？參照答案：外因：反應(yīng)條件、底物純度、反應(yīng)溫度和限制性內(nèi)切酶自身的活性；內(nèi)因：位點(diǎn)偏愛性；甲基化；底物的構(gòu)象。4.在酶切緩沖液中，一般需加入BSA，請問加入BSA的作用是什么？并簡述其原理？參照答案：作用是提供一定的蛋白質(zhì)濃度，起保護(hù)限制性內(nèi)切酶的作用。限制性內(nèi)切酶在稀釋液中會迅速變性，BSA是一種很好的可加入酶反應(yīng)液中的中性蛋白質(zhì)。5.何謂Staractivity？簡述Staractivity的影響原因及克服措施？參照答案：在極端非原則條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個(gè)變化的特性稱為星星活性。引起星星活性的的原因：①高甘油濃度（>5%）；②酶過量（>100U/ml）；③低離子強(qiáng)度（<25mM）；④高pH(>8.0)；⑤有機(jī)溶劑如PMSD（二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）和sulphalane等；⑥用其他二價(jià)陽離子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+替代Mg2+。星星活性的克制措施：①減少酶的用量，防止過量酶切，減少甘油濃度；②保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇；③提高離子強(qiáng)度到100～150mM（在不克制酶活性的前提下）；④減少反應(yīng)pH至7.0；⑤使用Mg2+作為二價(jià)陽離子。6.某DNA序列中存在DpnI酶切位點(diǎn)，以此DNA為模板，在體外合成DNA序列，當(dāng)用該酶進(jìn)行酶切時(shí)，發(fā)現(xiàn)切割不動，試分析也許原因？參照答案：生物體內(nèi)的DNA序列也許是通過甲基化修飾的，而在體外合成時(shí)，缺乏這種修飾作用。當(dāng)用依賴于甲基化的限制酶DpnI來切割非甲基化的序列時(shí)，就會出現(xiàn)不能切割的狀況。7.天然的質(zhì)粒載體（plasmidvectors）一般需經(jīng)改造后才能應(yīng)用，包括清除不必要的片段，引入多克隆位點(diǎn)等。試問在此過程中怎樣增減酶切位點(diǎn)？參照答案：在酶切水平上，通過酶切和連接產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。①將產(chǎn)生的5'突出端補(bǔ)平后，再連接以產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)；②同尾末端的連接，不一樣的同尾酶切割DNA產(chǎn)生的末端，再互相連接時(shí)，可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同步本來的酶切位點(diǎn)卻消失；③平末端的連接8.雙脫氧終止法測定DNA序列的片段一般不能太長，怎樣運(yùn)用本章所學(xué)知識測定較長片段的DNA序列？參照答案：①將所需要測序的DNA片斷采用2種不一樣的限制性內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生不一樣的酶切片段，將此酶切片段連接到載體上，測序后，拼接，即可得到全長的DNA序列；②用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行部分酶切，酶切產(chǎn)物與載體連接后，測序，拼接，即可得到全長DNA片斷。采用以上任一措施均可，需要注意的是，在進(jìn)行部分酶切時(shí)，應(yīng)當(dāng)控制好條件，要保證所得到的酶切片斷能覆蓋所需測序的DNA片斷。9.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，具有3'--5’參照答案：①運(yùn)用E.coliDNA聚合酶的5'--3'外切核酸酶活性，可用切口平移法標(biāo)識DNA，所有DNA聚合酶中只有此酶有此反應(yīng)；②用于cDNA克隆中的第二鏈，即單純的DNA聚合活性；③對3'突出端的DNA作末端標(biāo)識（互換或置換反應(yīng)）。10.用T4phageDNApolymerase可進(jìn)行末端標(biāo)識，試簡述其原理？參照答案：T4phageDNA聚合酶具有3'--5'外切活性和5'--3'的聚合酶活性，3'--5'的外切活性可以被5'--3'的聚合活性所封閉，首先在反應(yīng)體系中加入一種dNTP，產(chǎn)生3'凹端，然后加入通過標(biāo)識的dNTP，運(yùn)用T4phageDNA聚合酶的聚合活性補(bǔ)平3'凹端，即可得到標(biāo)識了末端的DNA片斷。11.BAP和CIAP有何作用？為何一般采用CIAP而不采用BAP？參照答案：作用：催化除去DNA或RNA5'磷酸。BAP抗性強(qiáng)，抗高溫和去污劑。CIAP可用蛋白酶K消化滅活，或在5mMEDTA下，65℃處理或7512.依賴于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌體RNA聚合酶和T4或T7噬菌體RNA聚合酶，此類聚合酶可用于體現(xiàn)外源基因，論述常用的構(gòu)建方略？參照答案：①將T7RNA聚合酶基因置于E.colilacUV5啟動子之下，插入到λ噬菌體中，感染E.coli，建立穩(wěn)定的溶源菌。E.coliBL21（DE3）菌株即為將lacUV5啟動子和T7聚合酶基因置于λ噬菌體DE3區(qū)，該λ噬菌體DNA整合于染色體的BL21處。若將T7噬菌體啟動子控制的目的基因經(jīng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入該宿主菌中，在IPTG誘導(dǎo)下，可啟動外源基因的體現(xiàn)；②先導(dǎo)入帶T7噬菌體啟動子控制的目的基因的質(zhì)粒，再用λ噬菌體（帶T7RNA聚合酶基因）感染E.coli，激活目的基因的體現(xiàn)。13.簡述T4多核苷酸激酶的活性和用途？參照答案：T4多核苷酸激酶的活性催化ATP的γ－磷酸基轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5'末端?？审w現(xiàn)為兩種反應(yīng)，正反應(yīng)指ATP的γ－磷酸基被轉(zhuǎn)移到去磷酸化的DNA5'端，用于對缺乏5'－磷酸的DNA進(jìn)行磷酸化。在互換反應(yīng)中，過量的ATP可使該激酶將磷酸化的5'端磷酸轉(zhuǎn)移給ADP，然后DNA從【γ－32P】ATP中獲得放射性標(biāo)識的γ－磷酸而重新磷酸化，因此可用于DNA的末端標(biāo)識。用途：該酶重要用于對缺乏5'－磷酸的DNA或合成接頭進(jìn)行磷酸化，同步可對末端進(jìn)行標(biāo)識。通過互換反應(yīng)，用于標(biāo)識5'末端，以供Maxam－Gilbert法測序、S1核酸酶分析以及其他須使用末端標(biāo)識DNA的環(huán)節(jié)。思索題問題：限制性內(nèi)切酶可劃分為哪幾種類型，各自有何特點(diǎn)？思索題問題：哪些酶可用于DNA片段的末端標(biāo)識？思索題問題：DNA聚合酶有哪些類型，各有什么活性？思索題問題：在分子克隆中所用的酶重要作用于哪些底物？第三章一.名詞解釋1.Vehicle載體。將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞（hostcell）的工具稱為載體。具有如下三個(gè)必須元件：復(fù)制原點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)識。2.Geneclone基因克隆?？寺∽鲃釉~時(shí)，指從單一祖先產(chǎn)生同一的DNA分子群體或細(xì)胞群體的過程；作名詞時(shí)指從一種共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所構(gòu)成的特殊的生命群體。運(yùn)用重組DNA技術(shù)分離目的基因，稱之為基因克隆。3.Genelibrary基因文庫。由大量的具有基因組DNA（即某畢生物的所有DNA次序）的不一樣DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體，稱之為基因文庫。4.Plasmidincompatibility質(zhì)粒不相容性。運(yùn)用同一復(fù)制系統(tǒng)的兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不波及DNA限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。5.α-complementationα-互補(bǔ)。指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的α-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)的互補(bǔ)。這兩個(gè)無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù)α-半乳糖苷酶的活性。6.X-gal/IPTG兩者都是乳糖的衍生物，X-gal：乳糖操縱子底物，可以作為生色劑，被α-半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落展現(xiàn)蘭色；IPTG：乳糖操縱子誘導(dǎo)物。7.lyticgrowth裂解生長狀態(tài)。噬菌體侵染宿主細(xì)胞后，大量復(fù)制并組裝成子代噬菌體顆粒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解的現(xiàn)象稱裂解生長狀態(tài)。8.lysogenicstate溶源狀態(tài)。噬菌體侵染宿主細(xì)胞后，將λ噬菌體基因組DNA通過位點(diǎn)專一性重組整合到宿主的染色體DNA中，并隨宿主的繁殖傳給子代細(xì)胞的現(xiàn)象稱溶源狀態(tài)。9.Multiplicityofinfection感染復(fù)數(shù)。指單個(gè)宿主細(xì)胞感染的噬菌體顆粒數(shù)，等于試驗(yàn)所用的噬菌體與細(xì)胞的數(shù)量之比。10.Insertionvectors插入型載體。通過特定的酶切位點(diǎn)容許外源DNA片段插入的載體稱為插入型載體。11.Replacementvectors置換型載體。而容許外源DNA片段替代載體的非必須DNA片段的載體，稱為置換型載體。12.Cosmid粘粒。帶有將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的cos序列的質(zhì)粒。包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，可以象質(zhì)粒同樣轉(zhuǎn)化并增殖；包括cos位點(diǎn)，可以象噬菌體顆粒同樣包裝、侵染。13.ReplicativeformDNA復(fù)制型DNA。在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删wDNA（正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈DNA，用于DNA的復(fù)制，這種雙鏈DNA稱為復(fù)制型DNA。14.Phagemid噬菌粒。具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)及單拷貝的絲狀體噬菌體重要基因間隔區(qū)的質(zhì)粒載體。此基因間隔區(qū)含病毒DNA合成的起始與終止及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必須的所有順式作用序列。含phagemid的細(xì)菌被噬菌體感染后，基因Ⅱ蛋白作用于間隔區(qū)，啟動滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生ssDNA并進(jìn)行包裝。15.M13K07helpphageM13KO7輔助噬菌體。M13單鏈絲狀噬菌體的衍生株，基因Ⅱ帶有一種G--T的突變。M13KO7基因組雙鏈DNA可體現(xiàn)產(chǎn)生子代單鏈DNA所必需的所有蛋白。M13K07中突變的基因Ⅱ產(chǎn)物與自身攜帶的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的作用尚不如它與克隆于噬菌粒pUCll8和pUCll9中的病毒復(fù)制起點(diǎn)的作用有效，可以保證在細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒顆粒中來自噬菌粒的單鏈DNA可以占據(jù)優(yōu)勢。16.Yeastartificialchromosomes酵母人工染色體載體。運(yùn)用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體稱為酵母人工染色體載體。由自主復(fù)制序列、著絲粒、復(fù)制子及選擇標(biāo)識等元件構(gòu)成。17.Bacterialartificialchromosomes細(xì)菌人工染色體。是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高通量低拷貝質(zhì)粒載體。包括嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)oriS、啟動DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動的解旋酶（(RepE)，以及三個(gè)保證低拷貝并使質(zhì)粒精確分派至子代細(xì)胞的基因座(parA,parB和parC)等元件）。18.P1artificialchromosomesP1人工染色體載體。結(jié)合了P1載體和BAC載體的特性，是P1噬菌體載體的改善載體。重組分子不能通過體外包裝來感染宿主細(xì)胞，而只能通過電轉(zhuǎn)化來將重組分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞。19.Shuttlevector穿梭載體?？梢栽趦深惒灰粯拥乃拗髦袕?fù)制、增殖和選擇的載體稱為穿梭載體。二.填空題1.載體（Vehicle）的類型有（），（），（），（）等。參照答案：質(zhì)粒載體；噬菌體載體；粘粒載體；噬菌粒載體2.Genecloning是指（），基因文庫（Genelibrary）是指（）。參照答案：運(yùn)用重組DNA技術(shù)分離目的基因；由大量的具有基因DNA（即某畢生物的所有DNA次序）的不一樣DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體3.Plasmid的定義是（），Plasmid能進(jìn)行自我復(fù)制，大多數(shù)為（）鏈（）狀DNA分子，大小一般為（）kb。染色體外的遺傳因子；雙；閉環(huán)；1～2004.（）即為質(zhì)粒的拷貝數(shù)，按照質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，質(zhì)?？梢苑譃椋ǎ┖停ǎǎ┵|(zhì)粒多數(shù)是某些具有轉(zhuǎn)移能力的大質(zhì)粒；（）質(zhì)粒多數(shù)是某些不具有轉(zhuǎn)移能力的小質(zhì)粒。參照答案：單個(gè)細(xì)胞中所具有的質(zhì)粒DNA分子數(shù)目；嚴(yán)謹(jǐn)型；松弛型；嚴(yán)謹(jǐn)型；松弛型填空題松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒融合后來，雜合質(zhì)粒一般優(yōu)先使用（）的復(fù)制子。松弛型5.（）稱之為質(zhì)粒的不相容性。假如兩個(gè)質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于同一種寄主細(xì)胞中，則它們屬于（）（填相似或不一樣）的不相容群。參照答案：兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象；相似6.質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)移性，它是指（），它需要（），（）和（）參照答案：在自然條件下，諸多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)；移動基因mob；轉(zhuǎn)移基因tra；轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)7.根據(jù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性可以將質(zhì)粒分為（）和（），一般大質(zhì)粒都是（），（）一般都是小質(zhì)粒，其上沒有（）參照答案：接合型質(zhì)粒；非接合型質(zhì)粒；接合型質(zhì)粒；非接合型質(zhì)粒；編碼其DNA轉(zhuǎn)移的基因8.按其用途可將標(biāo)識基因分為選擇標(biāo)識和篩選標(biāo)識，選擇標(biāo)識一般用于（），篩選標(biāo)識一般用于（）鑒別目的DNA（載體）的存在；將特殊表型的重組子挑選出來9.常用的用來鑒定重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌落的措施有（），（），（）等。參照答案：α－互補(bǔ)；插入失活；原位雜交10.pBR322質(zhì)粒是基因工程最重要的人工質(zhì)粒之一，它的大小約為（）kb，用于其組建的三個(gè)親本質(zhì)粒是（）,（）,和（）。此質(zhì)粒具有一種colE1松弛型質(zhì)粒復(fù)制子，兩個(gè)篩選標(biāo)識氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，其中colE1松弛型質(zhì)粒復(fù)制子來源于（），氨芐青霉素抗性基因來源于（），四環(huán)素抗性基因來源于（）參照答案：4.3；pM131；pSC101；pSF2124；pM131；pSF2124；pSC10111.pUC系列的質(zhì)粒載體是由（）和（）兩種質(zhì)粒構(gòu)建而來的，其中氨芐青霉素抗性基因來自于（），多克隆位點(diǎn)MCS來自于（）。pUC系列的質(zhì)粒載體一般是成對存在的如pUC18和pUC19，其重要區(qū)別是（）。參照答案：pBR322；M13mp18/19；pBR322；M13mp18/19；MCS方向不一樣12.質(zhì)粒載體的附加功能要素重要有（），（），（）等。參照答案：α－互補(bǔ)；ssDNAphageorigin，promotor13.λ噬菌體Genome的長度約為（）kb，其DNA分子為（）（填單或雙）鏈。它的DNA分子既可以以（）狀存在也可以以環(huán)狀存在，并且可以自然成環(huán)，其原因是在λ噬菌體的線性分子的兩端各有一種長度為（）個(gè)堿基的天然粘性末端，這種粘性末端可以自然成環(huán)，成環(huán)后的粘性末端就叫做（）。參照答案：50；雙；線；12；cos位點(diǎn)14.λ噬菌體在感染大腸桿菌后來，可以進(jìn)入Lyticgrowth也可以進(jìn)入Lysogenicstate。假如其基因組DNA通過專一性重組整合到宿主染色體中，則其進(jìn)入（）；它也可以選擇進(jìn)入（），大量復(fù)制并組裝子代噬菌體顆粒。Lysogenicstate；Lyticgrowth15.在λ噬菌體載體中，常用的選擇標(biāo)識有（），cⅠ基因失活，和（）等。參照答案：LacZ；spi篩選16.改造后的λ噬菌體才可用作載體，按照改造方式的不一樣可將其分為兩種類型，即插入型載體（insertionvectors）和替代型載體（replacementvectors）。其中Insertionvectors是指（）；Replacementvectors是指（）參照答案：通過特定的酶切位點(diǎn)容許外源DNA片斷插入的載體；容許外源DNA片斷替代載體的非必須DNA片斷的載體17.λgt10是一種由λ噬菌體衍生而來的insertionvectors，重要用于（）。它缺失了具有溶源整合的（）；λgt11載體也是一種insertionvectors，該載體的最大特點(diǎn)是在最左側(cè)可替代區(qū)置換了一段（）基因，可編碼β-半乳糖苷酶，在IPTG/X-gal平板上可形成（）色噬菌斑。參照答案：克隆小的cDNA；b257；lacZ；藍(lán)18.λ噬菌體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，其總的DNA長度應(yīng)當(dāng)在噬菌體genome的（）范圍內(nèi)。78%～105%19Cosmid實(shí)際上是由（）和（）構(gòu)成的雜合載體，也可以說是帶有（）序列的質(zhì)粒。cos位點(diǎn)；質(zhì)粒；cos20.染色體步查指（）。采用一段分離自某一重組體一端的非反復(fù)DNA片段作為探針以鑒定具有相鄰序列的重組克隆。21Cosmid的構(gòu)成包括三個(gè)部分：（），（）和（），其中復(fù)制子來源于（），cos序列來源于（）。質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；cos位點(diǎn)；抗性標(biāo)識；質(zhì)粒；噬菌體22.λ噬菌體的最大克隆片段是（）kb，Cosmid的最大克隆片段可到達(dá)（）kb。23；4523.運(yùn)用λ噬菌體載體構(gòu)建的genelibrary中，文庫是以（）的形式存在的；用質(zhì)粒載體構(gòu)建的genelibrary是以（）的形式存在的；粘粒載體構(gòu)建的genelibrary是以（）的形式存在的。噬菌斑；菌落；菌落24.M13噬菌體顆粒是（）狀的，其基因組為（）（填單或雙）鏈DNA。它只感染（）性大腸桿菌，感染宿主后來，其噬菌體顆粒的釋放不像λ噬菌體那樣要裂解宿主菌，而是（）。絲；單；雄；從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒25.M13噬菌體僅有兩個(gè)大的基因間隔區(qū)，分別位于（）與（）之間以及（）和（）之間，這些基因間隔區(qū)內(nèi)具有（）的元件。其中，（）稱為IG區(qū)，它有三個(gè)最重要的功能即（），（）和（）。參照答案：Ⅷ；Ⅲ；Ⅱ；Ⅳ；調(diào)整基因體現(xiàn)和DNA合成；GeneⅡ和GeneⅣ之間的間隔區(qū)；具有可對包裝及DNA在病毒顆粒中的定向進(jìn)行調(diào)控的順式作用因子；正鏈與負(fù)鏈DNA合成起始和終止位點(diǎn)；不依賴與ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止信號26.RFDNA是指（）。參照答案：復(fù)制型DNA，感染性的單鏈?zhǔn)删wDNA（正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈DNA，用于DNA的復(fù)制。27.M13K07輔助噬菌體是（）的衍生株，它帶有一種來自（）的復(fù)制起點(diǎn)，還帶有一種來自（）的卡那霉素抗性基因，用作選擇標(biāo)識；基因Ⅱ帶有一種（）的突變，導(dǎo)致基因蛋白質(zhì)第40位氨基酸由甲硫氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。參照答案：M13phage；p15A；Tn903；G-T28.YAC載體基本構(gòu)成元件有（），（），（），（）和（）。參照答案：復(fù)制起點(diǎn)；著絲粒；端粒；MCS；篩選標(biāo)識29.體現(xiàn)載體（Expressvector）是在常規(guī)載體的基礎(chǔ)上衍生而來的，其構(gòu)建的原理重要是增長一種（），以及有助于體現(xiàn)產(chǎn)物的分泌、分離或純化的元件；穿梭載體（Shuttlevector）是指（）體現(xiàn)元件；可以在兩類不一樣宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體三．選擇題1.氨芐青霉素的工作原理為（）A可以克制細(xì)胞壁肽聚糖的合成點(diǎn)評：B、D為四環(huán)素的工作原理；C為氯霉素的工作原理2.pUC18與pUC19的區(qū)別在于（）B兩者的多克隆位點(diǎn)方向相反點(diǎn)評：系列載體的區(qū)別一般不大，重要是克隆方向或讀碼框等方面的差異。3.載體所具有的特點(diǎn)中，如下描述不恰當(dāng)?shù)氖牵ǎ﹨⒄沾鸢福篋必須具有較高的拷貝數(shù)，便于制備點(diǎn)評：對于那些有劑量限制的基因克隆需要使用低拷貝的質(zhì)粒載體4.復(fù)制子由三部分構(gòu)成，如下不屬于的為（）D啟動子點(diǎn)評：理解質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)。5.pBluescriptM13載體在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)引入了T7和T3兩個(gè)噬菌體的啟動子，這樣增長了該載體的功能，如下4種功能哪一種是不對的的（）參照答案：D運(yùn)用這兩個(gè)啟動子進(jìn)行定點(diǎn)突變點(diǎn)評：理解pBluescriptM13載體的工作原理及特性。6.以粘粒為載體轉(zhuǎn)染受體菌后，平板上生長的菌落會出現(xiàn)大小不一、生長速度不一的現(xiàn)象，其原因是（）D重組體中插入片段的大小不一樣點(diǎn)評：插入片段自身的復(fù)制以及插入片段在宿主菌中的體現(xiàn)產(chǎn)物都會影響宿主的生長。7.噬菌粒是由質(zhì)粒和噬菌體DNA共同構(gòu)成的，其中來自質(zhì)粒的重要構(gòu)造是（），而來自噬菌體的重要構(gòu)造是（）A，A重組體中插入片段的大小不一樣點(diǎn)評：理解噬菌粒的生物學(xué)特性。8.野生型的M13有10個(gè)基因，分為三個(gè)功能基團(tuán)，其中與復(fù)制有關(guān)的兩個(gè)基因是（）A基因Ⅱ；基因Ⅳ點(diǎn)評：熟悉M13噬菌體的遺傳學(xué)性質(zhì)。9.M13單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制分為三個(gè)階段，如下哪一項(xiàng)不屬于此（）DSS→SS點(diǎn)評：RFDNA特指M13單鏈?zhǔn)删w復(fù)制型雙鏈DNA10.λ噬菌體DNA和M13單鏈?zhǔn)删wDNA在成熟前的DNA復(fù)制類型為（）A滾環(huán)復(fù)制模型點(diǎn)評：λ噬菌體DNA和M13單鏈?zhǔn)删w侵染宿主后，都是先θ復(fù)制模型，后轉(zhuǎn)為滾環(huán)復(fù)制模型。11.如下對pUC18的描述中，錯誤的為（）C可以在輔助質(zhì)粒的協(xié)助下合成單鏈DNA點(diǎn)評：pUC18沒有IG區(qū)，不也許形成單鏈。12.如下對粘粒為載體的重組體的描述對的的是（）B各重組體在平板上生長的速度不一樣，轉(zhuǎn)化子中插入片段的擴(kuò)增量也是不一樣的點(diǎn)評：理解粘粒載體的工作原理。13.下列哪種克隆載體對外源DNA的裝載量最大（）B酵母人工染色體（YAC點(diǎn)評：人工染色體包括YAC、BAC、PAC等，其特點(diǎn)是可以裝載大的（100kb以上）外源DNA片段。14.同一種質(zhì)粒DNA，以三種不一樣的形式存在，電泳時(shí)，它們的遷移速率是（）參照答案：BSCDNA>LDNA>OCDNA點(diǎn)評：DNA分子構(gòu)造越緊湊，泳動時(shí)受到的阻力越小，遷移速率越大。15.有關(guān)穿梭質(zhì)粒載體，下面哪一種說法最對的（）參照答案：A在不一樣的宿主細(xì)胞中使用不一樣的復(fù)制起點(diǎn)點(diǎn)評：可以在兩類不一樣的宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體稱為穿梭載體。16.反向反復(fù)序列：（）C可以回折形成發(fā)夾構(gòu)造17.λ噬菌體線性DNA分子的兩端各有一種（）個(gè)堿基構(gòu)成的天然黏性末端參照答案：B12點(diǎn)評：λ噬菌體線性DNA分子的兩端各有一種12個(gè)堿基構(gòu)成的天然粘性末端，稱為cos位點(diǎn)。18.下列有關(guān)細(xì)菌人工染色體（BAC）的特點(diǎn)描述，除（）以外都是對的的參照答案：BBAC載體在大腸桿菌中為高拷貝點(diǎn)評：細(xì)菌人工染色體。是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高通量低拷貝質(zhì)粒載體。包括嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)oriS、啟動DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動的解旋酶（RepE），以及三個(gè)保證低拷貝并使質(zhì)粒精確分派至子代細(xì)胞的基因座（parA，parB和parC）等元件。19.粘粒（cosmid）是一種人工建造的載體，下列對它的描述中哪一項(xiàng)是不對的的（）D進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起溶源化反應(yīng)點(diǎn)評：粘粒指帶有將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的cos序列的質(zhì)粒。包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，可以像質(zhì)粒同樣轉(zhuǎn)化并增殖；包括cos位點(diǎn)，可以像噬菌體顆粒同樣包裝、侵染。20.松弛型質(zhì)粒：（）A在寄主細(xì)胞中拷貝數(shù)較多點(diǎn)評：理解松弛型質(zhì)粒的概念。21.有關(guān)質(zhì)粒的不相容性，下列哪一種說法對的（）參照答案：C假如兩個(gè)質(zhì)粒不相容，闡明它們的復(fù)制機(jī)制相似點(diǎn)評：運(yùn)用同一復(fù)制系統(tǒng)的兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不波及DNA限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。22.一般狀況下，質(zhì)粒的存在狀況如下描述對的的是（）A獨(dú)立存在點(diǎn)評：質(zhì)粒指細(xì)菌或某些低等生物里面存在的獨(dú)立于染色體外的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子（目前也發(fā)既有線狀的），它常常攜帶某些不必需的遺傳信息。23.轉(zhuǎn)座子不包括下列哪個(gè)部分（）D反復(fù)序列點(diǎn)評：理解轉(zhuǎn)座子的概念。24.下列哪一項(xiàng)不是質(zhì)粒載體必備的基本特性（）D含lacZ點(diǎn)評：lacZ是一種篩選標(biāo)識，可以使載體使用的愈加以便，但不是載體的必需元件。25.質(zhì)粒的消失和染色體的突變是不一樣的，表目前（）參照答案：A前者不能恢復(fù)，后者可以通過答復(fù)突變恢復(fù)該基因的性狀點(diǎn)評：理解答復(fù)突變。26.如下的描述中，哪一項(xiàng)是對的的（）參照答案：C假如細(xì)菌的某種表型特性在UV處理下喪失后不再恢復(fù)，這種表型有也許是質(zhì)粒賦予的點(diǎn)評：理解質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)及質(zhì)粒載體的工作原理。27.線性質(zhì)粒復(fù)制的引物來自于（）參照答案：D自身末端的端粒序列點(diǎn)評：參照染色體的復(fù)制。28.下面有關(guān)松弛型質(zhì)粒的性質(zhì)描述中，（）是不對的的A一般帶有抗性標(biāo)識點(diǎn)評：氯霉素可以增長質(zhì)粒的復(fù)制，而不影響染色體的復(fù)制。29ColE1是唯一用作遺傳工程載體的自然質(zhì)粒，如下對這種質(zhì)粒描述不對的的是（）B具有四環(huán)素抗性點(diǎn)評：ColE1是自然質(zhì)粒，沒有四環(huán)素抗性基因，不能通過抗性篩選30.如下不是體現(xiàn)載體所必須的條件是（）C啟動子不需要受控制點(diǎn)評：體現(xiàn)載體與克隆載體相比就是多了體現(xiàn)所必須的多種遺傳元件。四.簡答題1.何為載體？一種理想的載體應(yīng)具有那些特點(diǎn)？參照答案：將外源DNA或目的基因攜帶入宿主細(xì)胞的工具稱為載體。載體應(yīng)具有：①在宿主細(xì)胞內(nèi)必須可以自主復(fù)制（具有復(fù)制原點(diǎn)）；②必須具有合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同步不影響其復(fù)制；③有一定的選擇標(biāo)識，用于篩選；④其他：有一定的拷貝數(shù)，便于制備。2.含pMB1或（ColE1）復(fù)制子的plasmid是怎樣復(fù)制的，其調(diào)整機(jī)制怎樣？參照答案：復(fù)制方式：在復(fù)制時(shí)，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并與DNA形成雜交體；而后RnaseH切割前RNAⅡ，使之成為成熟的RNAⅡ，并形成三葉草二級構(gòu)造。該引物引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。調(diào)整機(jī)制：形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二級構(gòu)造，同步Rop增強(qiáng)RNAⅠ的作用，從而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。減弱RNAⅠ和RNAⅡ之間互相作用的突變，將增長帶有pMB1或（ColE1）復(fù)制子的拷貝數(shù)。3.當(dāng)向細(xì)菌培養(yǎng)基中加入氯霉素時(shí)，可以使細(xì)菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)得到擴(kuò)增，試分析其原理？參照答案：pMB1質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依托宿主提供的半衰期較長的酶（DNA聚合酶Ⅰ，DNA聚合酶Ⅲ），依賴于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的產(chǎn)物。因此，雖然存在克制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時(shí)，帶有pMB1（或ColE1）復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最終每個(gè)細(xì)胞中可積聚2～3千個(gè)質(zhì)粒。4.抗性基因（Resistantgene）是目前使用的最廣泛的選擇標(biāo)識，常用的抗生素抗性有哪幾種？并舉兩例闡明其原理？參照答案：氨芐青霉素抗性基因（ampr）、四環(huán)素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr,neor）以及琥珀突變克制基因supF。青霉素克制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合，克制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并克制其活性。Ampr編碼一種酶，可分泌進(jìn)入細(xì)胞的周質(zhì)區(qū)，并催化β-內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除氨芐青霉素的毒性。四環(huán)素與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而克制核糖體的轉(zhuǎn)位。Tetr編碼一種由399個(gè)氨基酸構(gòu)成的膜結(jié)合蛋白，可制止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。5.何為α-complement？怎樣運(yùn)用α-complement來篩選插入了外源DNA的重組質(zhì)粒？參照答案：α-complementation指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。α-complementation是基于在兩個(gè)不一樣的缺陷β－半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。實(shí)現(xiàn)α-complement重要有兩部分構(gòu)成：LacZ△M15，放在F質(zhì)?；蛉旧w上，隨宿主傳代；LacZ'，放在載體上，作為篩選標(biāo)識，當(dāng)在LacZ'中插入一種片斷后，將不可防止地導(dǎo)致產(chǎn)生無α-complement能力的β－半乳糖苷酶片斷。在誘導(dǎo)物IPTG和底物X-gal（同步可作為生色劑）的作用下，含重組質(zhì)粒的菌落不能產(chǎn)生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解X-gal，展現(xiàn)白色，而含非重組質(zhì)粒的菌落則展現(xiàn)蘭色。以此到達(dá)篩選的目的。6.為何野生型的λ噬菌體DNA不適宜作為基因工程載體？參照答案：①野生型噬菌體DNA沒有容載能力，由于噬菌體的頭部對DNA包裝的量是有限制的，不能不小于基因組的105％，因此要將λ噬菌體改導(dǎo)致載體，必須削減分子量；②野生型的λ噬菌體對于某些常用的酶均有多種識別和切割位點(diǎn)，不便于克??；③沒有可供選擇的標(biāo)識；④野生型的λ噬菌體具有感染性，因此不夠安全。7.試簡述λ噬菌體的Lyticgrowth和Lysogenicstate兩種循環(huán)的分化及其調(diào)整過程？參照答案：Lyticgrowth是λ噬菌體在宿主中大量復(fù)制并組裝成子代λ噬菌體顆粒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。Lysogenicstate為λ噬菌體基因組DNA通過位點(diǎn)專一性重組整合到宿主染色體DNA中隨宿主的繁殖傳到子代細(xì)胞。調(diào)整過程：由感染復(fù)數(shù)和細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài)決定的，感染復(fù)數(shù)越高，營養(yǎng)狀態(tài)越差，則溶源化的頻率就越高。溶源現(xiàn)象的生化媒介也許是3'--5'cAMP，它在細(xì)胞內(nèi)的濃度會隨營養(yǎng)條件的變化而變化，當(dāng)細(xì)胞在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長時(shí)，cAMP的濃度較低，有助于裂解生長；在缺乏cAMP的突變細(xì)胞中，更有助于裂解生長此外一種重要的調(diào)整原因是噬菌體的CⅡ蛋白，它是噬菌體基因轉(zhuǎn)錄的激活子，克制裂解功能基因的體現(xiàn)，催化噬菌體DNA整合到細(xì)菌的染色體中去。高濃度的CⅡ蛋白增進(jìn)溶源化，而低濃度的CⅡ蛋白增進(jìn)裂解生長。當(dāng)CⅡ蛋白濃度足夠時(shí)，激活CⅠ蛋白和基因int的體現(xiàn)，導(dǎo)致噬菌體DNA與染色體整合，朝著溶源態(tài)生長。8.用λ噬菌體載體進(jìn)行g(shù)enecloning時(shí)，重要運(yùn)用λ噬菌體的生物學(xué)特性作選擇標(biāo)識，其中有cI失活和Spi篩選，請問什么叫cI篩選？什么叫Spi篩選？參照答案：CⅠ蛋白控制溶源態(tài)的形成，裂解生長受到克制，當(dāng)外源基因片段插入cⅠ中，cⅠ蛋白失活，溶源態(tài)打破而進(jìn)入裂解生長而篩選出重組克隆，叫做cⅠ篩選。野生型噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶源性E.coli中的生長會受到限制的表型，稱作Spi+，即對P2噬菌體的干擾敏感（sensitivetoP2interference）。假如λ噬菌體缺乏兩個(gè)參與重組的基因red和gam，同步帶有chi位點(diǎn)，并且宿主菌為rec+，則可以在P2溶源性E.coli中生長良好，噬菌體的這種表型稱作Spi-。因此，通過λ噬菌體載體DNA上的red和/或gam基因的缺失或替代，可在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中鑒別重組和非重組λ噬菌體。9.簡述λ噬菌體載體的克隆原理及一般環(huán)節(jié)？參照答案：λ噬菌體載體屬于克隆載體，重要用于克隆DNA片斷。工作原理：λ噬菌體載體克隆外源DNA片斷的原理與質(zhì)粒載體的工作原理是類似的，只是在形式上有許多差異。載體和外源DNA片斷通過酶切后，外源DNA片斷插入到載體的合適位置，或置換載體的填充片段。這種連接后的重組DNA保留增殖性能，但由于分子量太大，不能象重組質(zhì)粒DNA那樣可通過轉(zhuǎn)化措施進(jìn)入大腸桿菌。通過提取λ噬菌體的蛋白質(zhì)外殼，可在體外將重組噬菌體DNA進(jìn)行包裝，形成噬菌體顆粒。這樣的噬菌體顆粒保留對大腸桿菌的感染能力，可將被包裝的重組噬菌體DNA注射到宿主菌中。通過裂解生長，可增殖重組噬菌體?？寺…h(huán)節(jié)：①通過裂解過程增殖載體；②載體與外源DNA的酶切；③外源DNA與載體的連接；④重組噬菌體的體外包裝；⑤包裝噬菌體顆粒的感染；⑥篩選。10.Cosmid的工作原理是什么？參照答案：粘粒載體的重要原理類似λ噬菌體載體。在外源片斷與載體連接時(shí)，粘粒載體相稱于λ噬菌體載體的左右臂，cos位點(diǎn)通過粘端退火后，再與外源片斷相間連接成多聯(lián)體。當(dāng)多聯(lián)體與λ噬菌體包裝蛋白混合時(shí)，λ噬菌體A基因蛋白的terminase功能將切割兩個(gè)cos位點(diǎn)，并將兩個(gè)同方向cos位點(diǎn)之間的片斷包裝到λ噬菌體顆粒中去。這些噬菌體顆粒感染大腸桿菌時(shí)，線狀的重組DNA就象λ噬菌體DNA同樣，被注入細(xì)胞并通過cos位點(diǎn)環(huán)化。這樣形成的環(huán)化分子具有完整的粘粒載體，可象質(zhì)粒同樣復(fù)制并使其宿主獲得抗藥性。因而，帶有重組粘粒的細(xì)菌可用含合適抗生素的培養(yǎng)基挑選。通過這種方式，就將外源DNA片斷通過粘粒載體克隆到大腸桿菌中去了。11.構(gòu)建粘粒文庫時(shí)會碰到哪些問題？你怎樣處理？參照答案：運(yùn)用粘粒構(gòu)建基因文庫時(shí)會碰到許多困難：①載體分子會自身連接，從而導(dǎo)致效率大大減少甚至失敗。通過對載體作去磷酸化處理或使用雙cos位點(diǎn)載體或?qū)d體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行部分補(bǔ)平可處理這一問題；②多種外源片斷插入載體中，會誤將兩個(gè)本來不相連的DNA片斷認(rèn)為是基因組中的持續(xù)DNA片斷。通過搜集35～45kb的部分酶切外源DNA片斷與載體連接、使用雙cos位點(diǎn)載體或?qū)d體和外源片斷的酶切產(chǎn)物進(jìn)行部分補(bǔ)平，可處理這一問題。③提取的基因組DNA長度不不小于200kb，將使部分酶切后形成的35～45kb片斷只有少部分在其兩端帶有酶切位點(diǎn)，致使目的DNA的可用性大大減少。在對外源DNA片斷作部分酶切之前，應(yīng)檢查其大小，假如不不小于200kb則不能用于構(gòu)建文庫；④提取的總DNA純度不高，也許由于出現(xiàn)酶解克制物而得不到理想的酶切產(chǎn)物。因此，在制備總DNA時(shí)，應(yīng)小心防止混入的有機(jī)相和水相交界處的物質(zhì)。假如問題仍舊出現(xiàn)，可用氯化銫梯度離心措施純化DNA或重新制備總DNA；⑤在構(gòu)建的文庫中常常出現(xiàn)不含外源片斷的克隆。這種“空”克隆的比例依載體的不一樣和操作的小心程度而不一樣一般而言，使用單cos位點(diǎn)的載體，約有5％的克隆是空的。使用雙cos位點(diǎn)的載體，產(chǎn)生空克隆的比例要低得多；⑥不一樣重組質(zhì)?？截悢?shù)可以有很大差異，導(dǎo)致收獲量相差懸殊。每當(dāng)對文庫作一次噬菌體的擴(kuò)增，這些差異將會被深入放大；⑦盡管文庫似乎全面，但也許不能獲得目的克隆。限制酶位點(diǎn)的非隨機(jī)分布、包裝蛋白污染限制酶、重組引起的序列缺失和擴(kuò)增時(shí)目的克隆也許被淘汰等都是產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因。12.絲狀噬菌體克隆中常常會碰到哪兩類問題？可用何種措施來處理？參照答案：①外源DNA區(qū)段的部分缺失，克隆于絲狀噬菌體基因間隔區(qū)的外源基因趨于不穩(wěn)定。外源基因越大，缺失突變率越高，盡量防止帶有讓感染細(xì)菌在液體培養(yǎng)中持續(xù)生長，可以使這種現(xiàn)象減少到最低程度（盡管不能完全消除）。對的的做法是，用保留于－70℃的重組噬菌體原種轉(zhuǎn)染合適的宿主菌，鋪成平板，并從分隔良好的單個(gè)噬斑的中央挑取細(xì)菌進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)；②13.噬菌粒（Phagemid）具有那些特性？許多phagemid均有一種重要的缺陷，即在輔助噬菌體感染后，有時(shí)候單鏈DNA的產(chǎn)量較低且反復(fù)性一般較差，試分析其原因？參照答案：①雙鏈DNA既穩(wěn)定，又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特性；②免卻了將外源DNA片斷從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體；③由于載體足夠小，故可得到長達(dá)10kb的外源DNA區(qū)段的單鏈。原因：①噬菌體攜帶的基因間隔區(qū)確實(shí)切序列，攜帶完整基因間隔區(qū)的質(zhì)?？捎捎诟蓴_輔助病毒DNA復(fù)制而克制子代噬菌體顆粒的產(chǎn)生；②基因間隔區(qū)插入質(zhì)粒的詳細(xì)位置，基因間隔區(qū)插入pBR322HindⅢ位點(diǎn)所構(gòu)成的噬菌粒，會嚴(yán)重干擾野生型噬菌體的生長，而將基因間隔區(qū)插入AhaⅢ位點(diǎn)則否則；③輔助噬菌體的性質(zhì)，野生型絲狀噬菌體及其抗干擾突變株都被用作輔助噬菌體。輔助噬菌體基因間隔區(qū)插入了lacZ序列，因而基因Ⅱ產(chǎn)物對它的識別不那么有效；④克隆于噬菌粒的外源DNA的大小與性質(zhì)，因外源DNA片斷的大小而異，單鏈DNA的產(chǎn)量可以在5～10倍之間有所差異（一般來說，外源DNA越大，產(chǎn)量越低）。此外，由于某些尚不清晰的原因，大小相似的外源DNA，其單鏈DNA的產(chǎn)量也參差不齊。14.YAC載體具有什么樣的功能性元件？為何它在克隆大片段時(shí)具有很大的優(yōu)越性？參照答案：YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一種著絲粒，一種復(fù)制起點(diǎn)，兩個(gè)端粒。YAC可以容納長達(dá)幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和粘粒辦不到的。大片斷的插入更有也許包括完整的基因，在染色體步移中每次容許更大的步移距離，同步減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。思索題問題：作為一種最基本的載體，它必須具有哪些功能元件？思索題問題：何為α-互補(bǔ)？在載體構(gòu)建中有何作用？思索題問題：請簡要描述?噬菌體溶原狀態(tài)和裂解循環(huán)的基因調(diào)控模式，及其在構(gòu)建載體中的作用。思索題問題：簡述M13K07輔助噬菌體的遺傳學(xué)特性和生物學(xué)功能，及其在制備單鏈DNA中的作用。第四章一.名詞解釋1.TAEbuffer醋酸緩沖液。由Tris堿、醋酸和EDTA等成分構(gòu)成的緩沖體系，用于瓊脂糖凝膠電泳。2.SDS十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。用于檢測蛋白質(zhì)分子量的電泳措施，待分離蛋白質(zhì)是變性的，泳動速率只與分子量有關(guān)，與自身所帶電荷無關(guān)。3.SouthernblotSouthern雜交。一種檢測DNA分子的措施。將DNA片段從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到濾膜，結(jié)合了DNA分子的濾膜先與特定的預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)雜交，然后與標(biāo)識的核酸探針和濾膜混合。假如濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上。在通過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去后，通過放射自顯影或生化檢測，就可判斷濾膜上與否存在與探針同源的DNA分子及其分子量。4.NorthernblotNorthern雜交。用于檢測細(xì)胞或組織樣品中與否存在與探針同源的mRNA分子的檢測措施。過程與Southern雜交相似，只不過在Blotting過程中轉(zhuǎn)移的是RNA而不是DNA。5.WesternblotWestern雜交。用來檢測細(xì)胞或組織樣品中與否存在能被某抗體識別的蛋白質(zhì)的措施。將蛋白質(zhì)樣品從SDS凝膠通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到濾膜，通過抗體以免疫反應(yīng)形式檢測濾膜上與否存在被抗體識別的蛋白質(zhì)，并判斷其分子量。所用的探針不是DNA或RNA，而是針對某一蛋白質(zhì)制備的特異性抗體。6.Colonyhybridization菌落雜交。