考研科目,動物生物化學 第17章 核酸技術(shù)

第17章核酸技術(shù)DNA重組技術(shù)基因操作的主要技術(shù)核酸技術(shù)的應(yīng)用生長激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“碩鼠”（1）重要的工具酶（2）載體（3）DNA重組的過程1DNA重組技術(shù)（1）重要的工具酶

它能夠識別、切割雙鏈DNA分子中的特定序列，這些特定序列多數(shù)為反向重復序列，一般長度是4、5或6bp。

①限制性內(nèi)切酶粘性末端：識別序列對稱軸，左右兩邊切開，形成凸出部分。

如

EcoRI:5’---GAATTC

CTTAAG---3’

5’－GGCC－3’3’－CCGG－5’HaeⅢ平頭末端：識別序列中間切開同裂酶：產(chǎn)生相同的切割，形成相同的末端同尾酶：識別不同的序列，形成相同的末端②DNA連接酶

相鄰DNA的5′磷酸基團和3′羥基形成磷酸二酯鍵。目前使用的連接酶有兩種：大腸桿菌DNA連接酶：黏性末端連接；

T4連接酶：黏性和平齊末端連接。③堿性磷酸酶催化DNA和RNA5′－磷酸基團水解，產(chǎn)生5′－羥基末端，減少載體自身的環(huán)化。（2）載體

能將外源DNA帶入宿主細胞，進行復制擴增或最終使外源基因得以表達的自主DNA，稱為載體（vector）。分為：

①克隆載體：用于基因的復制、擴增、測序等；②穿梭載體：原核與真核細胞間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移；③表達載體：用于目的基因的表達。

（3）DNA重組的過程

①

目的基因的獲得

②

選擇和制備載體③將目的基因與載體進行切割連接④將重組體導入受體細胞

⑤

陽性克隆的篩選和鑒定

⑥D(zhuǎn)NA重組體的擴增、表達等研究目的基因克隆的基本過程①目的基因的制備直接從染色體中分離人工合成逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫

PCR擴增②

載體的選擇和制備

原核生物常用的載體：質(zhì)粒和噬菌體；真核生物常用的載體：動物病毒、酵母；穿梭載體：通常是指那些既能在真核細胞中繁殖又能在原核細胞中繁殖的載體。③目的基因與載體的酶切與連接④

重組DNA導入宿主細胞大腸桿菌、酵母、真菌及各種真核細胞、受精卵細胞都可用于重組。

轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染--------

（1）轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒導入宿主細胞的過程。（2）轉(zhuǎn)導：通過噬菌體或病毒的感柒作用將外援基因?qū)爰毦倪^程。（3）轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒為載體構(gòu)建的重組體導入宿主細胞的過程。⑤

目的基因的篩選和鑒定遺傳標記法核酸雜交法PCR方法免疫學鑒定物理篩選遺傳學方法（表型）

利用載體的特殊標記,如質(zhì)粒含有抗青霉素的基因，當含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可在含有青霉素的培養(yǎng)基中生長，而未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細菌在同樣的條件下不能生長。分子雜交技術(shù)Southern-blot印跡雜交原理示意圖

菌落原位雜交23626③聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR,DNApolymerasechainreaction）DNA核苷酸序列分析

Sanger雙脫氧鏈終止法④酶切鑒定目的基因表達

⑥

3DNA技術(shù)的應(yīng)用

(1)DNA指紋技術(shù)(2)轉(zhuǎn)基因動物與動物克隆

(3)基因診斷與基因治療

(1)DNA指紋技術(shù)(DNAfingerprint)

DNA指紋技術(shù)是20世紀70年代末發(fā)展起來的遺傳標記（geneticmarker）的方法。

遺傳標記是指可用來區(qū)分不同群體或個體，又能穩(wěn)定遺傳的某些物質(zhì)。生物個體間的差異在本質(zhì)上是DNA的差異，因此DNA是最可靠的遺傳標記。

①限制性片段長度多態(tài)性

（restrictionfragmentlength

polymorphism，RFLP）

真核生物的DNA分子很長，在遺傳過程中DNA堿基由于替換、重排、插入、缺失等原因，在子代DNA中會引起差異形成多態(tài)性。

用一種限制性內(nèi)切酶去切DNA時，DNA分子會降解成許多長短不等的片段，個體間這些片段是特異的，可以作為某一DNA的標記，將這種方法稱為限制性片段長度多態(tài)性。

在人體DNA文庫中發(fā)現(xiàn)的由9–70bp重復單位串聯(lián)重復排列而成的高變異區(qū)，稱為小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）。

所有真核生物基因組中還存在由2-6bp為重復單位的重復順序，因其重復單位比小衛(wèi)星短，稱為微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA）。

②

DNA指紋圖譜（DNAfingerprint）。

不同個體的多態(tài)性來源于重復單位的重復次數(shù)不同。同一家族小衛(wèi)星重復單位含有相同或相似的核心序列，用某一小衛(wèi)星DNA作探針，可與同一或不同物種多酶切DNA片段雜交，獲得高度個體特異性圖譜稱DNA指紋圖譜。

人的DNA指紋圖譜DNA指紋圖譜的特點：

①一次能夠檢測十幾個、甚至幾十個位點的變異性，有效的反應(yīng)組織的特異性。

②具有很高的變異性。

③

DNA指紋圖譜譜帶從親代遺傳給子代，兒女的指紋圖譜中幾乎每一條的圖譜中找到。

④

DNA指紋圖譜具有體細胞穩(wěn)定性，從同一個體不同組織。③

隨機擴增多態(tài)性DNA（RandomlyAmplifiedpolymorphicDNA，RAPD）

是以9–10個核苷酸的隨機序列作引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增。產(chǎn)物電泳后紫外觀察，不同個體的圖帶差異明顯，如DNA指紋圖譜一樣。

(2)轉(zhuǎn)基因動物與動物