《細(xì)胞生物學(xué)》-細(xì)胞2章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法雨課堂23

前測(cè)題2.顯微鏡的分辨率與放大倍數(shù)無關(guān)（）2.顯微鏡的分辨率與放大倍數(shù)無關(guān)（）√×AB提交單選題10分Chapter2.TechniquesinCellBiologyPreparatoryobserve

putforwardtheoreticsDesigncontroltestsCollectdataExplainresultsDeviseconclusion

Refertoknowledge

本章內(nèi)容提要第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化第五節(jié)模式生物與功能基因組的研究第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡(lightmicroscopy)

二、電子顯微鏡(Electromicroscopy)三、掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope)幾種顯微鏡可觀察的樣品大小（箭頭之間的范圍）及其分辨能力（右側(cè)箭頭所指位置）分辨率(resolution)：能區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離眼睛、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的分辨率分別為：0.2mm、0.2μm和0.2nm一、光學(xué)顯微鏡(lightmicroscopy)（一）、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡（二）、相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡（三）、熒光顯微鏡（四）、激光掃描共焦顯微鏡（一）、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡成像示意圖光學(xué)顯微鏡（最大分辨率為0.2μm），主要由三部分組成：①光學(xué)放大系統(tǒng)，即目鏡和物鏡；②照明系統(tǒng)，包括光源和聚光鏡③鏡架及樣品調(diào)節(jié)系統(tǒng)。放大倍數(shù)：目鏡的放大倍數(shù)х物鏡的放大倍數(shù)隨堂練習(xí)1.關(guān)于光鏡的使用，下列正確的是（）A.觀察標(biāo)本時(shí)，應(yīng)雙眼同時(shí)睜開，雙手并用B.按照從低倍鏡到高倍鏡到油鏡的順序進(jìn)行操作C.使用油鏡時(shí)，需在標(biāo)本上滴香柏油，將聚光器降至最低，光圈關(guān)至最小D.使用油鏡時(shí)，不可一邊在目鏡中觀察，一邊下降鏡筒或上升載物臺(tái)1.關(guān)于光鏡的使用,下列正確的是()觀察標(biāo)本時(shí),應(yīng)雙眼同時(shí)睜開,雙手并用A按照從低倍鏡到高倍鏡到油鏡的順序進(jìn)行操作B使用油鏡時(shí),需在標(biāo)本上滴香柏油,將聚光器降至最低,光圈關(guān)至最小C使用油鏡時(shí),不可一邊在目鏡中觀察,一邊下降鏡筒或上升載物臺(tái)D提交多選題10分決定光學(xué)顯微鏡的分辨率（resolution）的要素

D＝0.61λ∕［N·sin(α/2］D:分辨率λ：入射光的波長(最短400nm)N：介質(zhì)的折射率（1或1.5）α：物鏡的鏡口角(最大140°）生物樣品的制備過程：①固定：可使生物大分子交聯(lián)，蛋白質(zhì)成分凝固，防止細(xì)胞自溶和破壞而產(chǎn)生人工假象。常用固定劑：甲醛、戊二醛、乙醇②包埋：為了便于切片，防止樣品移位常用包埋劑：石蠟③切片：由于生物樣品太厚，不能直接用光鏡觀察，需切成1-10μm的薄片④細(xì)胞不同成分的選擇性染色細(xì)胞總重量的70%是水，對(duì)可見光來說幾乎是透明的，因此未經(jīng)處理的細(xì)胞在普通光鏡下幾乎是看不見的，為使細(xì)胞成為可見的常用方法就是染色。常用的染料：蘇木素對(duì)負(fù)電荷分子有親和力，可顯示細(xì)胞內(nèi)核酸的分布(藍(lán)紫色）；伊紅可使細(xì)胞質(zhì)染色（紅色）。石蠟切片的制備程序隨堂練習(xí)3.標(biāo)本常用的固定液為（）A.20%甲醛B.40%甲醛C.10%福爾馬林D.20%福爾馬林E.75%酒精3.標(biāo)本常用的固定液為()20%甲醛A40%甲醛B10%福爾馬林C20%福爾馬林D75%酒精E提交單選題10分隨堂練習(xí)4.切片的常規(guī)染色方法是（）A.蘇木素染色B.伊紅染色C.瑞氏染色D.巴氏染色E.蘇木素-伊紅染色 4.切片的常規(guī)染色方法是()蘇木素染色A伊紅染色B瑞氏染色C巴氏染色D蘇木素-伊紅染色E提交單選題10分

（二）、相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡

只有光線通過染色的標(biāo)本時(shí)其波長、振幅發(fā)生變化，人眼才能看見，但活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本由于光波長和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到，但其相位有變化，因此利用光的干涉和衍射效應(yīng)把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比。兩束光波之間的相互干涉A：相位相同時(shí)B:相位相反時(shí)

（二）、相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）：

一種將相位差轉(zhuǎn)變成振幅差（明暗差）的顯微鏡，可觀察不染色的活細(xì)胞。

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

一種將樣品厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別相差顯微鏡。相差顯微鏡相差顯微鏡比普通光鏡多了2個(gè)部件：（1）在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間（一個(gè)光圈，只有光圈的能透過，其他地方的光都被擋住了）（2）在物鏡后焦面增加一個(gè)相板（annularphaseplate）：

，相板上有一個(gè)環(huán)形區(qū)，通過環(huán)形區(qū)的光比從其他區(qū)域透過的光超前或滯后1/4λ，這樣就使通過標(biāo)本不同區(qū)域光波的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睢?/p>

相差顯微鏡可觀察活細(xì)胞的各種運(yùn)動(dòng)，如細(xì)胞遷移、分裂、運(yùn)動(dòng)等。甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)。

體外培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞的圖像A：普通顯微鏡所拍B：相差顯微鏡所拍隨堂練習(xí)5.關(guān)于相差顯微鏡的敘述，下列正確的是（）A.用于觀察活細(xì)胞和未染色的生物標(biāo)本B.細(xì)胞各部分細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度不同，光波通過時(shí)，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化（振幅差），這種振幅差肉眼無法觀察C.相差顯微鏡通過改變相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本D.可以用于超微結(jié)構(gòu)的觀察5.關(guān)于相差顯微鏡的敘述,下列正確的是()用于觀察活細(xì)胞和未染色的生物標(biāo)本A細(xì)胞各部分細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度不同,光波通過時(shí),波長和振幅并不發(fā)生變化,僅相位發(fā)生變化(振幅差),這種振幅差肉眼無法觀察B相差顯微鏡通過改變相位差,并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象,把相位差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本C可以用于超微結(jié)構(gòu)的觀察D提交多選題10分微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡用的是偏振光，偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。1952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)硅藻（三）、熒光顯微鏡（fluorescencemicroscopy）

細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后發(fā)出可見光線，稱為熒光；自發(fā)熒光：由細(xì)胞本身存在的物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后發(fā)出的熒光。誘發(fā)熒光：另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖啶橙等熒光色素）或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。熒光顯微鏡可對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究。光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。是目前在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位最有力的工具。熒光顯微鏡技術(shù)主要是用于檢測(cè)細(xì)胞上的特異熒光材料，與普通光學(xué)顯微鏡不同的是熒光顯微鏡增加了兩套濾光片。第一套稱為激發(fā)光濾片，裝在光源和樣品之間，只有那些能激發(fā)熒光材料發(fā)光的特定波長的光才能通過。第二套稱為阻斷濾片，裝在物鏡和目鏡之間，只讓染料所發(fā)出的熒光通過。在黑暗背景的襯托下，發(fā)出熒光的樣品很容易被觀察。

不同熒光素所需激發(fā)波長與所產(chǎn)生的熒光波長比較在有絲分裂中期中，紡錘體微管呈綠色中期染色體呈藍(lán)色原纖維狀蛋白呈紅色利用GFP進(jìn)行的蛋白質(zhì)的

基因工程化改造隨堂練習(xí)6.綠色熒光蛋白GFP（GreenFluorescentProtein）基因與目的基因融合后，轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可以（）A.檢測(cè)融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位B.檢測(cè)目的基因所編碼的蛋白在細(xì)胞中的含量C.檢測(cè)目的基因所編碼的蛋白在細(xì)胞中的分子結(jié)構(gòu)D.檢測(cè)目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)量6.綠色熒光蛋白GFP(GreenFluorescentProtein)基因與目的基因融合后,轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可以()檢測(cè)融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位A檢測(cè)目的基因所編碼的蛋白在細(xì)胞中的含量B檢測(cè)目的基因所編碼的蛋白在細(xì)胞中的分子結(jié)構(gòu)C檢測(cè)目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)量D提交多選題10分（四）、激光掃描共焦顯微鏡

(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)

用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。激光掃描共焦顯微鏡的原理圖激光束經(jīng)雙色鏡反射后，通過物鏡匯聚到樣品某一焦點(diǎn)；從焦點(diǎn)發(fā)射的熒光經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢測(cè)器檢出；樣品其他部位發(fā)射的熒光不會(huì)聚焦成像，因而檢測(cè)器不能檢出。熒光顯微鏡（A）和激光掃描共焦顯微鏡（B）所觀察圖像的比較隨堂練習(xí)7.關(guān)于激光掃描共焦顯微鏡的敘述，錯(cuò)誤的是（）A.共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到一個(gè)小點(diǎn)B.可以自動(dòng)改變觀察的焦平面而且縱向分辨率得到改善C.可以通過光學(xué)切片觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并可重構(gòu)三維圖像D.相比普通熒光顯微鏡分辨率提高50倍7.關(guān)于激光掃描共焦顯微鏡的敘述,錯(cuò)誤的是()共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到一個(gè)小點(diǎn)A可以自動(dòng)改變觀察的焦平面而且縱向分辨率得到改善B可以通過光學(xué)切片觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu),并可重構(gòu)三維圖像C相比普通熒光顯微鏡分辨率提高50倍D提交單選題10分二、電子顯微鏡(Electromicroscopy)（一）、電子顯微鏡的基本知識(shí)

1.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

2.電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)

3.電子顯微鏡的基本構(gòu)造（二）、主要電鏡制樣技術(shù)

1.超薄切片技術(shù)

2.負(fù)染色技術(shù)

3.冷凍蝕刻技術(shù)

4.電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)

5.掃描電鏡技術(shù)（一）、電子顯微鏡的基本知識(shí)1.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別2.電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)3.電子顯微鏡的基本構(gòu)造1.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別2.電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.2μm左右，其放大倍數(shù)為0.2mm/0.2μm，即1000倍電子顯微鏡的分辨率可達(dá)0.2nm，其放大倍數(shù)為106倍上述放大倍數(shù)稱之為有效放大倍數(shù)電鏡的分辨本領(lǐng):是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率電鏡的實(shí)際分辨率常常受到生物制樣技術(shù)本身的限制電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（A）和成像原理（B）3.電子顯微鏡的基本構(gòu)造電鏡的基本構(gòu)造包括：①電子束照明系統(tǒng)；②電磁透鏡成像系統(tǒng)；③真空系統(tǒng)；④記錄系統(tǒng)；4、1932年Ruska制備第一臺(tái)電子顯微鏡。1935年法國的卡諾爾提出掃描電鏡的設(shè)計(jì)思想和工作原理。1942年劍橋大學(xué)的馬倫首次制成世界第一臺(tái)掃描電鏡5、分類：透射電鏡（TransmissionelectronMicroscope,TEM）掃描電鏡（ScanningelectronMicroscope,SEM）（二）、主要電鏡制樣技術(shù)1.超薄切片技術(shù)：切片厚度一般僅為40～50nm2.負(fù)染色技術(shù)：用重金屬鹽對(duì)電鏡樣品進(jìn)行染色的技術(shù)，使得重金屬鹽沉積在樣品周圍，而樣品不被染色，從而襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。3.冷凍蝕刻技術(shù)：樣品經(jīng)冷凍斷裂后，在真空中短暫暴露，使斷裂面上的一層薄冰升華，暴露出蝕刻面，以便在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。4.電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)5.掃描電鏡技術(shù)：利用電子在樣品表面掃描產(chǎn)生二次電子成像的顯微鏡。1.超薄切片技術(shù)（ultrathinsection)超薄切片技術(shù)顯示的動(dòng)物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)隨堂練習(xí)8.用電子顯微鏡觀察的生物樣品會(huì)有一些特殊要求，如要求樣品很薄及更好地保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)（）8.用電子顯微鏡觀察的生物樣品會(huì)有一些特殊要求，如要求樣品很薄及更好地保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)（）√×AB提交單選題10分2.負(fù)染色技術(shù)(negativestaining)家蠶細(xì)小病毒負(fù)染色電鏡照片（病毒直徑20nm）3.冷凍蝕刻技術(shù)(freezeetching)隨堂練習(xí)9.經(jīng)冷凍蝕刻技術(shù)處理后的樣品，在電子顯微鏡下所觀察到的圖像是樣品本身所形成的（）9.經(jīng)冷凍蝕刻技術(shù)處理后的樣品,在電子顯微鏡下所觀察到的圖像是樣品本身所形成的()AB提交√×單選題10分4.電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前在結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）領(lǐng)域用于研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。低溫電子顯微技術(shù)：其樣品不經(jīng)固定、染色和干燥，直接包被在約100nm厚的冰膜中，在電鏡內(nèi)-160℃低溫下利用相位襯度成像；研究生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)。單顆粒技術(shù)：研究核糖體的三維結(jié)構(gòu)及在蛋白質(zhì)合成中的動(dòng)態(tài)變化電子掃描斷層成像技術(shù)：研究細(xì)胞核細(xì)胞器三維精細(xì)結(jié)構(gòu)電子掃描斷層成像技術(shù)顯示細(xì)菌的部分鞭毛及其復(fù)雜的基部結(jié)構(gòu)（箭頭所指）5.掃描電鏡技術(shù)（Scanningelectronmicroscope，SEM）

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成像。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題圖像為立體形象，反映了樣品的表面形貌。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴鍍一層金膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)掃描電鏡原理示意圖（A），

掃描電鏡下可清晰地顯示原生動(dòng)物四膜蟲表面的纖毛和口器（B）人類血細(xì)胞SEM照片隨堂練習(xí)10.掃描電子顯微鏡主要用于觀察

，常常采用

對(duì)生物樣品進(jìn)行干燥。為了得到良好的表面導(dǎo)電性，樣品在觀察前還需要

。10.掃描電子顯微鏡主要用于觀察[填空1]，常常采用[填空2]對(duì)生物樣品進(jìn)行干燥。為了得到良好的表面導(dǎo)電性，樣品在觀察前還需要[填空3]。作答正常使用填空題需3.0以上版本雨課堂填空題30分隨堂練習(xí)11.透射或掃描電子顯微鏡不能用于觀察活細(xì)胞，而相差顯微鏡或倒置相差顯微鏡可以用于觀察活細(xì)胞（）11.透射或掃描電子顯微鏡不能用于觀察活細(xì)胞,而相差顯微鏡或倒置相差顯微鏡可以用于觀察活細(xì)胞()正確A錯(cuò)誤B提交單選題10分

三、掃描隧道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope，STM)

一種利用隧道效應(yīng)來探測(cè)微觀世界物質(zhì)表面形貌的顯微鏡。第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)

一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分

原理：利用顆粒大小的不同：差速離心法；速度區(qū)帶離心法；利用顆粒密度的不同：等密度離心法用途：離心是研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體等細(xì)胞器，以及各種大分子基本手段。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)速為10000-25000r/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速超過25000r/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)80000r/min，離心力超過500Kg。高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)臺(tái)式高速離心機(jī)貝克曼超速離心機(jī)RCF(relative

centrifugal

field)即表示相對(duì)離心場(chǎng)，以重力加速度g（980.66cm/s2）的倍數(shù)來表示rpm(revolution

per

minute，或r/min)表示離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)r

表示離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心管中心的距離（如下圖所示），單位為cm。由于離心管的位置由轉(zhuǎn)子（rotor）決定，因此r

必須由查閱相關(guān)轉(zhuǎn)子的參數(shù)而得。用差速離心法分離細(xì)胞勻漿中的各種細(xì)胞組分用密度梯度離心分離細(xì)胞組分示意圖二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法為了測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)等細(xì)胞組分，通常利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合（反應(yīng)）的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對(duì)含量。

福爾根(Feulgen)反應(yīng)可特異顯示DNA的存在部位。

PAS（高碘酸-希夫）反應(yīng)可確定多糖的存在。四氧化鋨可證明脂肪滴的存在。蘇丹Ⅲ和蘇丹黑也常用于脂肪的鑒定。米倫反應(yīng)及重氮反應(yīng)等用來測(cè)定蛋白質(zhì)。檢測(cè)和定位酶的技術(shù)是基于細(xì)胞或組織切片與適宜底物共同孵育，通過一定方法使產(chǎn)物顯示出來。例如檢測(cè)堿性磷酸酶的格莫瑞方法。三、特異蛋白抗原的定位與定性（一）、免疫熒光技術(shù)（二）、免疫電鏡技術(shù)（一）、免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)就是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合研究特異蛋白質(zhì)抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。包括直接和間接免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟：熒光抗體的制備、標(biāo)本的處理（組織切片、冷凍切片、整裝細(xì)胞）、免疫染色、觀察記錄等優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限直接免疫熒光標(biāo)記與間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)直接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：利用偶聯(lián)熒光分子的抗體與細(xì)胞或細(xì)胞切片進(jìn)行孵育，使抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下對(duì)抗原進(jìn)行定位的技術(shù)。間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：即不帶熒光標(biāo)記的第一抗體與相應(yīng)抗原孵育形成復(fù)合物后，再用熒光標(biāo)記的第二抗體識(shí)別第一抗體，從而顯示抗原所在位置。（二）、免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)使特異蛋白的定位與超微結(jié)構(gòu)結(jié)合起來，使抗原定位更準(zhǔn)確。如蛋白分泌的研究胞內(nèi)酶的研究；一些結(jié)構(gòu)蛋白的研究。免疫鐵蛋白技術(shù)：鐵蛋白是含鐵離子的蛋白質(zhì)，在電鏡下鐵離子可顯黑色；免疫膠體金技術(shù)

:即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它與抗體標(biāo)記后，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)可定位抗原的存在。應(yīng)用：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等免疫酶標(biāo)技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA），辣根過氧化物酶（HRP）免疫鐵蛋白電鏡技術(shù)（鐵蛋白分子量大，應(yīng)用在膜上）免疫膠體金電鏡技術(shù)（膠體金分子量非常小，可穿透細(xì)胞膜，應(yīng)用在溶酶體等）

免疫膠體金電鏡原位雜交技術(shù)的基本原理與應(yīng)用（膀胱上皮細(xì)胞膜蛋白的分布：箭頭所指）ELISA蛋白電泳(SDS）與

免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)基本原理：通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。DYCZ-24DN型

迷你雙垂直電泳儀(槽)（小號(hào)）

DYCZ-40D型

迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(槽)

問題：B圖和C圖分別是用什么染色，靈敏度分別是大于多少ng?A圖B圖C圖實(shí)驗(yàn)方案？雙向電泳（2D電泳）單向SDS電泳分辨率差，只能分開50左右種的蛋白。雙向電泳可分辨1000種以上的蛋白質(zhì)，一般為2000-15000種

步驟：1、等電聚焦電泳；2、在垂直于第一次電泳的方向上進(jìn)行SDS電泳四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交（insituhybridization）：通過單鏈RNA或DNA探針對(duì)細(xì)胞或組織中的基因或mRNA進(jìn)行定位的技術(shù)。光鏡水平的原位雜交技術(shù)（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）電鏡水平的原位雜交技術(shù)（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

把凝膠電泳分離開的DNA片段，通過擴(kuò)散或電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，做成一個(gè)凝膠的復(fù)制品，這個(gè)過程叫做印跡。將硝酸纖維素膜與帶有放射性標(biāo)記的探針雜交，通過放射自顯影就可以辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊的核苷酸序列。利用標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)某一特定的DNA序列的方法稱為Southernblot，檢測(cè)特定RNA序列的方法稱為Northernblot。

PCR技術(shù)和DNA測(cè)序方法用原位雜交技術(shù)顯示Z13基因在受精后1d的斑馬魚胚胎的體節(jié)、眼和松果體中的表達(dá)（箭頭所指）放射自顯影技術(shù)

原理：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；應(yīng)用：實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究步驟：摻入、制片、敷膠、曝光、顯影、鏡檢

五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometer,FCM）：一種用于核酸、蛋白質(zhì)、染色體和細(xì)胞等的定量、分離和分選的技術(shù)。特點(diǎn)：測(cè)量速度快，幾萬個(gè)細(xì)胞/秒；可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；綜合了多學(xué)科的科技成果；既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)；應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體。

流式細(xì)胞儀的工作原理第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)（一）、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（二）、植物細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)：用直接從生物體獲得的細(xì)胞所進(jìn)行的培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：在體外培養(yǎng)條件下對(duì)細(xì)胞一代接一代的持續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞系（cellline）：來源于動(dòng)物或植物細(xì)胞，能夠在體外培養(yǎng)過程中無限增殖的細(xì)胞群體。

體外培養(yǎng)的細(xì)胞A：正在生長分裂的HeLe（宮頸瘤）細(xì)胞B:長滿單層的CHO（中國倉鼠卵巢）原代細(xì)胞二、細(xì)胞工程（一）、細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)（二）、顯微操作技術(shù)與動(dòng)物的克隆細(xì)胞融合(cellfusion)：兩個(gè)細(xì)胞通過質(zhì)膜的接觸并相互融合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合后的細(xì)胞只有一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞質(zhì)膜。單克隆抗體(monoclonalantibody)：來自單個(gè)細(xì)胞克隆所分泌的抗體分子。雜交瘤技術(shù)(hybridomastechniques)：由一個(gè)正常的產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與一個(gè)惡性骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜種細(xì)胞系。具有無限增殖和產(chǎn)生單克隆抗體的特性。細(xì)胞拆合(Celldivisionandcombination

)：即先把細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離開來，然后把不同來源的核體和胞質(zhì)體相互融合，形成核-質(zhì)雜交細(xì)胞。單克隆抗體制備過程示意圖應(yīng)用顯微注射技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞核移植第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)二、單分子技術(shù)與細(xì)胞生命活動(dòng)的研究三、酵母雙雜交技術(shù)四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)五、放射自顯影技術(shù)一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)：一種研究膜組分流動(dòng)性的技術(shù)。通過膜組分與熒光染料連接，用激光不可逆地漂白膜上的某一熒光區(qū)域，然后根據(jù)漂白區(qū)熒光恢復(fù)的速度，研究膜的流動(dòng)性。熒光漂白恢復(fù)技術(shù)原理示意圖二、單分子技術(shù)與細(xì)胞生命活動(dòng)的研究單分子技術(shù)：一種在細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)觀測(cè)單一生物分子運(yùn)動(dòng)規(guī)律的技術(shù)，可在納米空間尺度和毫秒時(shí)間尺度上精確測(cè)量單分子的距離、位置、指向、分布、結(jié)構(gòu)以及各種動(dòng)態(tài)過程。利用光鑷來研究生物單分子體系三、酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)：一種利用酵母基因表達(dá)系統(tǒng)在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。用于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的

酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)：一種用來檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子是否直接相互作用的技術(shù)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理圖五、放射自顯影技術(shù)放射自顯影技術(shù)：通過檢測(cè)放射性標(biāo)記物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位來觀察某一特定生化反應(yīng)過程的技術(shù)。在含有放射性同位素的組織切片上涂一薄層感光乳膠，乳膠經(jīng)組織發(fā)出的射線曝光、顯影，在顯微鏡下通過觀察銀顆粒定位，可以獲知細(xì)胞中有放射性信號(hào)的位點(diǎn)。常用放射性同位素的基本特點(diǎn)電鏡放射自顯影圖片（顯示RNA合成部位）N：細(xì)胞核Nu：核仁SG：銀顆粒第五節(jié)模式生物與功能基因組的研究一、細(xì)胞生物學(xué)研究常用的模式生物二、突變體制備技術(shù)三、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞生物學(xué)研究常用的模式生物（一）、大腸桿菌（二）、酵母（三）、線蟲（四）、果蠅（五）、斑馬魚（六）、小鼠（七）、擬南芥二、突變體制備技術(shù)RNA干擾（RNAi）：一種把雙鏈小分子（或單鏈反義）RNA導(dǎo)入細(xì)胞或模式生物體中使某mRNA降解或抑制其翻譯活性的技術(shù)。