獼猴桃汁對n-二甲基亞硝胺合成的阻斷作用

獼猴桃汁對n-二甲基亞硝胺合成的阻斷作用

硝基化合物是已知的最具化學(xué)致癌物質(zhì)之一。已經(jīng)用120多種化合物進(jìn)行了動物實驗。其中約80%是致癌物質(zhì)，可誘導(dǎo)各種動物（包括靈長類）的器官和組織的腫瘤。一些實驗結(jié)果也顯示出亞硝胺對人類有致癌的可能。亞硝基化合物,特別是它們的前體一硝酸鹽、亞硝酸鹽和胺類廣泛存在于食品及人類的環(huán)境中,從典型化合物的體外實驗及動物喂養(yǎng)研究,推測在人胃中存在著亞硝化反應(yīng)的適宜條件,內(nèi)源性亞硝胺合成可能是人體攝入亞硝胺的主要來源。已證明維生素C和維生素E等能在體內(nèi)外阻斷亞硝胺合成,這方面有很多報道。1979年我們用我國野果一獼猴桃進(jìn)行亞硝胺體外形成阻斷作用的研究,結(jié)果證明獼猴桃汁對亞硝基嗎啉體外合成的阻斷作用優(yōu)于同濃度的維生素C溶液和美國檸檬汁。在以上工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了獼猴桃汁對二甲基亞硝胺體外合成的阻斷作用。文獻(xiàn)報告氨基比休和亞硝酸鈉在pH1-4的條件下能合成二甲基亞硝胺,后者經(jīng)肝微粒體酶代謝活化后,具有致突變作用。我們試圖以獼猴桃汁來阻斷上述亞硝化反應(yīng),用鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(簡稱Ames試驗)進(jìn)行證明。不同菌株的生化鑒定(1)獼猴桃汁:河南省西峽縣果酒廠制造的獼猴桃汁罐頭(1981年產(chǎn)品),經(jīng)巴氏消毒,未加糖及防腐劑。pH3.25—3.32,維生素C含量35mg%,冰盒貯存。(2)亞硝酸鈉:分析純,天津市化學(xué)試劑一廠產(chǎn)品。精密稱取6.000g,溶于20.0ml滅菌蒸餾水中,4℃冰箱貯存不超過一周。實驗前用無菌蒸餾水稀釋成所需的濃度。(3)氨基比林:化學(xué)純,北京化工廠產(chǎn),溶液配制同亞硝酸鈉。(4)維生素C溶液:分析純;北京化工廠產(chǎn),精密稱維生素C140mg,用滅菌磷酸緩沖液稀釋至50ml容量瓶中,濃度為280mg%;用棕色小瓶分裝,放置冰盒內(nèi)貯存不超過一周。實驗前稀釋成35mg%的維生素C溶液;用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值使之與獼猴桃汁一致。(5)磷酸緩沖液:(6)TA100菌株:使用前進(jìn)行鼠傷寒沙門氏菌變異株特性鑒定:①組氨酸需求試驗;②結(jié)晶紫敏感試驗;③紫外線照射試驗;④氨基芐青霉素(Ampicillin)試驗;⑤自發(fā)回變數(shù)測定,五項檢查全部合格,放置4℃冰箱貯存。(7)S-N肝微粒體酶:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤所流行病科提供,液氮中保存。(9)6-磷酸葡萄糖:純度98%;美國Sigma化學(xué)公司。(10)氯化鎂(Mgcl2·6H2O);分析純,北京紅星化工廠。(11)磷酸氫銨鈉(NaN4HPO4·4H2O):化學(xué)純,上海產(chǎn)品。(13)氯化鈉:分析純,北京化工廠。(14)磷酸二氫鉀:分析純,北京紅星化工廠。(15)瓊脂粉:日本進(jìn)口分裝,上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站。(16)組氨酸鹽酸鹽:化學(xué)純,北京化工廠(17)D(+)葡萄糖:分析純,北京化工廠。(18)電熱恒溫水浴箱:北京市西城區(qū)醫(yī)療器械廠,溫度波動±0.5℃。ames反應(yīng)體系的致突變性試驗無菌操作下,在15ml塞試管中加入pH.3磷酸緩沖液3.0ml,或等量的獼猴桃汁,或維生素C溶液。然后分別加入不同濃度的亞硝酸鈉和氨基比林(在同一體系中兩種前體濃度相同),充分混勻后立即計時,在37℃水浴中準(zhǔn)確保溫一小時。以同樣方式將各種濃度的亞硝酸鈉或氨基比林單獨處理,觀察前體物質(zhì)的致突變性。上述五種不同的反應(yīng)體系組成為:①亞硝酸鈉和氨基比林;②亞硝酸鈉、氨基比林加獼猴桃汁;③亞硝酸鈉、氨基比林加維生素C;④亞硝酸鈉;⑤氨基比林;此外還做了陽性對照及S9無菌對照。一小時后,每管保溫混合液中取0.1ml作為測試樣本,按Ames平皿摻入法進(jìn)行非活化或活化試驗檢查反應(yīng)體系中的致突變性,經(jīng)37℃培養(yǎng)48小時后,以每皿菌落數(shù)均值與自發(fā)回變均值對比,等于或超過自發(fā)回變菌落數(shù)2倍者為致突變陽性反應(yīng)。非活化試驗重復(fù)兩次,活化試驗重復(fù)了三次。結(jié)果(1)不經(jīng)代謝活化活性用TA100菌株測定結(jié)果,在所測定的0.5—8.Omg/ml范圍內(nèi),每皿菌落數(shù)均值未達(dá)到自發(fā)回變菌落的2倍,證明二甲基亞硝胺不經(jīng)代謝活化沒有致突變活性。(2)acnda的合成a)在亞硝酸鈉和氨基比林反應(yīng)體系中,從4mg/ml的濃度,回變菌落數(shù)開始增多,但未達(dá)到自發(fā)回變的2倍;在5mg/ml及以上時,菌落數(shù)均值達(dá)到了自發(fā)回變的2倍以上,提示在一定條件下,反應(yīng)體系中的亞硝酸鈉和氨基比林能夠合成致突變物一亞硝胺,經(jīng)過肝微粒體酶代謝,產(chǎn)生致突變活性。同樣條件下處理的樣品,經(jīng)水蒸汽蒸餾、二氯甲烷萃取濃縮后,用氣相色譜、質(zhì)譜聯(lián)儀(Gc—Ms)分析測定,確認(rèn)為二甲基亞硝胺(NDMA)。其質(zhì)譜圖接近日本進(jìn)口的標(biāo)準(zhǔn)品。b)在5mg/ml的亞硝酸鈉和氨基比林反應(yīng)體系中加入獼猴桃汁后,能阻斷二甲基亞硝胺的合成,每皿菌落數(shù)均值為252±8.4,小于自發(fā)回變數(shù)的2倍,未出現(xiàn)致突變作用。與未加入阻斷劑的亞硝酸鈉和氨基比林反應(yīng)體系相比(456±50.6),差異有顯著性(P<0.01).而同濃度的維生素C溶液對亞硝胺合成的阻斷效率明顯低于桃汁,每皿菌落數(shù)均值為445±81.2;兩種阻斷劑的差異有顯著性(P<0.01)見表1、表2和圖1。C)在同樣條件下單獨測定亞硝酸鈉或氨基比林,在本實驗反應(yīng)體系1.0—8.0mg/ml各濃度中,均未出現(xiàn)致突變活性。對模擬誤差的檢測已有實驗證明,用胺類藥物和亞硝酸鈉作為前體物質(zhì),在人胃液中能合成亞硝胺。我們的興趣在于,用富含維生素C和多種營養(yǎng)成分的天然食品一獼猴桃汁阻斷亞的合成。通過鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗,測定反應(yīng)體系中有無致突變性物質(zhì)來證明此效果,并與已知的亞硝胺阻斷劑維生素C的阻斷作用進(jìn)行比較。目前國內(nèi)外尚未見到這方面的資料,過去的研究工作多選用結(jié)晶維生素C或其鹽作為阻斷劑,曾有不少報道。考慮到二甲基亞硝胺是食品中較常見的一種化學(xué)致癌物質(zhì),本實驗設(shè)計選用了它的前體物質(zhì)亞硝酸鹽和氨基比林作為研究對象,前者存在于人類的食物、飲水及生活環(huán)境中,后者是一種普通的藥物,如果兩者在一定的條件下同時攝入胃中,就可能合成NDMA,對人體造成潛在的致癌危險。人的胃液pH為1-4,是亞硝胺合成的適宜場所。本實驗以獼猴桃汁的平均pH值(3.3)作為反應(yīng)條件,并配制了與桃汁pH相同的維生素C溶液和磷酸緩沖液作為對照。各反應(yīng)體系分別在37℃水浴中保溫一小時后,取混合液進(jìn)行致突變性的檢測。在本實驗測定的各濃度組中(1.0—8.0mg/ml)以同樣條件分別處理亞硝酸鈉和氨基比林,未測出致突變性。以后又用GC—Ms確證了反應(yīng)體系中的氨基比林和亞硝酸鈉合成了NDMA,因此可以認(rèn)為Ames試驗中的致突變活性是NDMA所致。目前各國的許多實驗室都在以鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗作為篩選環(huán)境中可疑致癌物的一個常規(guī)手段,但是使用這種生物測定方法來觀察已知致癌物亞硝胺的體外合成及阻斷作用,對我們來說還是一種新的嘗試。在測定中我們發(fā)現(xiàn)NDMA雖然是一種很強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì),但是在Ames試驗中表現(xiàn)為弱致突物。從本實驗1.0—8.Omg/ml的反應(yīng)體系中每皿菌落數(shù)均值:213,226,346,456,454,可以看出隨著濃度的增加,菌落數(shù)在一定范圍內(nèi)也有所增加。從表2的結(jié)果可以看出,加入桃汁后,在5mg/ml和8mg/ml的反應(yīng)體系中,每皿菌落數(shù)均值都未達(dá)到陽性范圍(<374/皿)。同樣條件下測定兩種前體物質(zhì)亞硝酸鈉或氨基比林,未見致突變作用。但是在超過實驗范圍的高濃度亞硝酸鈉(>20mg/ml)試樣中,如果不經(jīng)過37℃水浴保溫,直接用TA100或TA1535兩菌株檢查,則出現(xiàn)陽性反應(yīng)。雖然實際情況不會出現(xiàn)這樣過高的濃度(如胃中達(dá)此濃度可引起急性中毒甚至死亡),但亞硝酸鈉的可疑致突性仍應(yīng)引起重視。我們所報告的結(jié)