蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳

蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳PS:非原創(chuàng)，都是本人在考研時收集的，有些相對重要的地方我標上了顏色~~雙向凝膠電泳(2-DE)的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。近年來經(jīng)過多方面改進已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價值的核心方法。分離蛋白質(zhì)組所有蛋白的兩個關(guān)鍵參數(shù)是其分辨率和可重復性。在目前情況下，雙向凝膠電泳的一塊膠板(16cmX20cm)可分出3~4千個，甚至1萬個可檢測的蛋白斑點，這與10萬個基因可表達的蛋白數(shù)目相比還是太少了。80年代開始采用固定化pH梯度膠，克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范圍(如0.05U/cm),對特別感興趣的區(qū)域可在較窄的pH范圍內(nèi)做第二輪分析，從而大大提高了分辨率。此種膠條已有商品生產(chǎn)，因此基本上解決了雙向凝膠電泳重復性的問題。這是雙向凝膠電泳技術(shù)上的一個非常重要的突破。第二向SDS有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法，可分離10~100kD分子量的蛋白質(zhì)。其中靈敏度較高的銀染色法可檢測到4ng蛋白，最靈敏的還是用同位素標記，20ppm的標記蛋白就可通過其熒光或磷光的強度而測定。用圖像掃描儀、萊賽密度儀、電荷組合裝置可把用上述方法得到的蛋白圖譜數(shù)字化，再經(jīng)過計算機處理，去除縱向和橫向的曳尾以及背景底色，就可以給出所有蛋白斑點的準確位置和強度，得到布滿蛋白斑點的圖像，即所謂“參考膠圖譜”。蛋白質(zhì)組研究的主要困難是對用雙向凝膠電泳分離出來的蛋白，進行定性和定量的分析。最常用的方法是先把膠上的蛋白印跡到PVDF(polyvinylidenedifluoride)膜上后再進行分析，確定它們是已知還是未知蛋白?，F(xiàn)在的分級分析法是先做快速的氨基酸組成分析，也可先做4?5個循環(huán)的N末端微量測序，再做氨基酸組成分析；結(jié)合在電泳膠板上估計的等點電和分子量，查對數(shù)據(jù)庫中已知蛋白的數(shù)據(jù)，即可作出判斷。有文獻報道，N末端4個殘基序列的數(shù)據(jù)就可以給出很多的信息而得到相當準確的結(jié)果。如再結(jié)合C末端序列，判斷結(jié)果的準確性會更高。對分離得到的蛋白質(zhì)作進一步的確切鑒定需要有足夠數(shù)量的純蛋白，電泳時蛋白質(zhì)已經(jīng)過了高度純化?，F(xiàn)在一塊膠板可允許上到高達mg數(shù)量級的樣品，因此每個分離的蛋白斑點可有Mg數(shù)量的蛋白，這樣使本來是微量的蛋白也可希冀被鑒定。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進行的化學反應(yīng)，如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵形成，以及最近發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)自剪接等等，可能有一百種以上。翻譯后修飾和加工對蛋白質(zhì)的正常生理功能是必需的，它們的變化往往和疾病的發(fā)生有關(guān)。用雙向凝膠電泳可以進行翻譯后修飾的研究，如用32P標記可以研究磷酸化蛋白的變化。雙向凝膠電泳中?？砂l(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)拖曳現(xiàn)象，很可能是一個蛋白的不同翻譯后修飾產(chǎn)物所造成的。拖曳圖像變化在疾病診斷上可能提供重要的信息。雙向凝膠電泳技術(shù)當前面臨的挑戰(zhàn)是：（1）低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調(diào)節(jié)蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化質(zhì)譜用到PVDF膜上，但當前的技術(shù)還不足以檢出拷貝數(shù)低于1000的蛋白質(zhì)。（2）極酸或極堿蛋白的分離。（3）極大（＞200kD）或極?。╒lOkD=蛋白的分離。（4）難溶蛋白的檢測，這類蛋白中包括一些重要的膜蛋白。（5）得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)，因此迫切需要自動二維電泳儀的出現(xiàn)。雙向電泳操作方法1蛋白質(zhì)樣品制備秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進行。lOOmg材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%B—巰基乙醇），混勻，-20°C沉淀1小時，4°C,15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復溶于1.5ml冷丙酮（含10mMp-巰基乙醇），再于-20C沉淀1小時，同上離心棄上清，（有必要再用80%丙酮（含10mMp-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。按每mg干粉加入20ml（可調(diào)）UKS液［9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS,0.5%DTT（二硫蘇糖醇），2%Ampholine（AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10），6%TritonX-100］，37C育30min,期間攪動幾次，28度（溫度低，高濃度的尿素會讓溶液結(jié)冰）16000r/min離心15min，離心力越大時間長一點越好！上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存2蛋白質(zhì)濃度測定按Garrels(1983)的程序，稍加改動。10pl上述用UKS液制得的蛋白質(zhì)樣品中加入40pl水及50pl20%三氯乙酸，冰浴30min后，4°C,4000r/min離心15min,棄上清，再加入100pl冷丙酮，同上離心5min，棄上清，凍干沉淀，用100plPBS溶液復溶，并按Bradford(1976)的程序測定蛋白質(zhì)濃度。電聚焦(IEF)玻管準備干凈玻管(18cmX1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm處作好標記，垂直放在泡沫板上。電聚焦的管子，買原裝的也可以，實在不行自己也可以做的，1ml的移液管，內(nèi)徑1.5mm左右的，長度取18cm，用玻璃刀做，玻璃管的處理，先用2M的NaOH泡至少1hr，用自來水沖后;用雙蒸水沖，用雙蒸水泡至少1hr，中間至少換2,3次水;后用2M的HCL泡至少1個小時，用雙蒸水沖，(不能用自來水沖)，然后雙蒸水泡至少1個小時，中間換3，4次水，可多泡一會。最后泡在無水乙醇里面1hr，烘干就可以用了.凝膠制備與電聚焦灌IEF的配方為3.09克尿素1.125ml10%NP-401.125ml水0.735ml30%屏息現(xiàn)案(ACR28.38BIS1.62)0.15mlAm3.5-100.375mlAm5-78衛(wèi)生10%AP1.8衛(wèi)生TEMED用注射器吸好膠液，裝上7號針頭，將7號針頭插入玻管底部，邊推注射器邊提針頭，直到標記處，用微量進樣器小心加入少量水，可見明顯的界面出現(xiàn)，讓其聚合1小時以上，適當長一點的時間更好。待膠聚合好后，除去Parafilm并吸去頂部的覆蓋液，加樣80pg,上面再小心加入50mmol/LNaOH至管口，不要破壞樣品與NaOH的界面。即可進行電泳。電極液為：上槽（負極）為50mmol/LNaOH液，下槽（正極）為25mmol/LH3PO4。按200VX15min,300VX30min,400VX18h,1000VXlh的程序進行電聚焦。或者直接400V17hr1000V2hrveryimportantthingis跑第一向一定要在保持在37度左右，第一向溫度特別重要，不然，電聚焦肯定不好.電泳后的凝條處理電聚焦完畢后，用注射器吸滿水，套上一個200pl的槍頭，當然槍頭與注射器間用parafilm封住防漏氣。從頂部向下注水使膠條向下滑出注射器槍頭玻璃管必須為一直線。取一膠條，用雙蒸水洗凈兩端，按酸端到堿端的順序切成0.5cm的小段，各自浸入含1.3ml抽氣后雙蒸水的Eppendorf管中過夜，次日用酸度計分別測定各段的pH值，以凝膠長度為橫坐標，pH值為縱坐標作圖，即為等電點標準曲線。漫漫擠管子,200衛(wèi)生槍頭,注射器，要成一直線，，要用一手扶著管子，一手拿住200衛(wèi)生槍頭，保證水不從槍頭和管子處流出來，注射器頂在胸前把膠條擠出后，放在12%TCA里面，在4度可以保存很久，在平衡之前，要用ddwater泡30min,而且要換至少5次水,每次用不同的小平皿。對要進行第二向SDS的膠條則必須用平衡液［2.3%SDS,62.5mmol/LTris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%B—巰基乙醇，0.1%溴酚藍］進行二次平衡，第一次20min,第二次25min。第2次的溶液為新的。平衡過程中每隔幾min輕輕的晃一下小平皿。2.3.2第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離膠濃度為12%，無濃縮膠。待膠聚合后，將電聚焦后已經(jīng)平衡的膠條平放于濃縮膠頂端（避免膠條拉直），并用1%瓊脂糖（電極緩沖液配制）封膠，特別應(yīng)注意避免膠條與分離膠上沿產(chǎn)生氣炮。61廠板子之灌膠：堅決不用凡士林，用透明膠將兩端（板子的2邊）封住，再用2%瓊脂之SDS電極液封底，待瓊脂凝固后再灌膠，最后用水封膠。1，灌膠不會有任何問題，不能漏，2，不用濃縮膠，只用分離膠。3，分離膠用水封，要保證凝聚好的PAGE膠，為一平的線。用透明膠（約4cm寬），封住兩邊，下面還是用2%的瓊脂封。灌好電極緩沖液［25mmol/LTris,192mmol/L甘氨酸及0.1%SDS］，按25mA/板膠恒流進行電泳，待溴酚蘭離底部1cm時即可停止電泳，一般電泳耗時約4-5h。銀染：凝膠于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者過夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2X20min；水洗6X5min；0.02%硫代硫酸鈉1min；水洗3X20s；0.2%硝酸銀，0.02%甲醛快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進去,馬上又倒掉;0.2%硝酸銀，0.02%甲醛20min；水洗3X20s；顯色液（3%碳酸鈉，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸鈉）快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進去,馬上又倒掉;顯色液（3%碳酸鈉，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸鈉）顯色到你所希望的程度,自己看,背景好,點又多的話就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停顯。染色理想溫度：最好是20度左右。10%TCA,0.07%2-ME丙酮（100ml）:100%TCA10ml2-ME0.07ml丙酮90ml0.07%2-ME丙酮（100ml）:2-ME0.07ml丙酮100ml0Farrel液（9.5MUrea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5%2-ME）50mlUrea28.5gNP-401mlAmpholine5~72.0ml3.5~100.5ml2-ME2.5ml定容，配好后用1.5ml管分裝！-70度保存UKS液(含9.5MUrea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%TritonX-100)25ml50mlUrea14.25g28.5gK2CO317.25mg34.5mgSDS0.3125g0.625gDTT0.125g0.25g2-MEAmpholine(3.5~10)1.25ml2.5mlTritonX-1001.5ml3ml(0.86ml2槍，4槍)2-ME可適當加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分裝！-70度保存！雙向電泳IPG一、樣品提?。喝却姿帷恋矸ㄔ谝旱醒心ト~片加入樣品體積3倍的提取液在-20°C的條件下過夜，然后離心(4°C8000rpm以上1小時)棄上清。加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的卩-巰基乙醇)，搖勻后離心(4°C8000rpm以上1小時)，然后真空干燥沉淀，備用。上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心(15°C8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準)，可臨時保存在4°C待用。用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80°C備用。二、一向電泳(13cm的holder)取大約70-100ng的蛋白與溶脹液混合總體積達到250vl將上述溶液加到holder的兩個電極之間。3)去掉膠條的保護膜，膠面朝下，先將膠條尖端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢下壓膠條，并前后移動，避免生成氣泡，最后放下膠條平端，使溶液浸濕整個膠條。（4）在膠條上覆蓋適量的覆蓋油，蓋上蓋子。（5）將膠條槽平放于一向儀器上，與水平方向垂直。（6）設(shè)置儀器的運行參數(shù)：三、膠條的平衡（由一向到二向）（1） 將膠條放入10ml平衡緩沖液中（加入lOmgDTT）封口，在振蕩儀上振蕩15分鐘。（2） 將膠條取出放入10ml新的平衡緩沖液中（加入250mg的碘乙酰胺）封口，在振蕩儀上振蕩15分鐘。（3） 用去離子水潤洗膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘，以去除多余的平衡緩沖液。四、二向電泳（1） 將平衡好的膠條直接轉(zhuǎn)移到第二向制好的SDS膠上，然后用瓊脂糖封頂，準備第二向電泳.（2） 設(shè)置儀器的運行參數(shù)：五、平板膠的染色硝酸銀染色：（整個操作在搖床上進行）（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml去離子水，60分鐘。（2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入），17g醋酸鈉，165ml去離子水，30分鐘。（3） 清洗：用250ml的去離子水清洗3次每次5分鐘。（4） 銀染：0.625g硝酸銀，250去離子水，（使用之前配制）20分鐘。（5） 顯色：6.25g碳酸鈉，100vl的甲醛（使用之前加入），250ml去離子水。（6） 終止：5%的醋酸。（7）照相分析。8）保存制作干膠。藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的0-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。平衡緩沖液：1.5MTris—Clph8.86.7ml,尿素72.07g,87%的甘油69ml,SDS4g,溴酚藍少許。溶漲液：尿素12g,CHAPS0.5g,溴酚藍少許溶于無菌水中，總體積為25ml。使用之前再加入IPG緩沖液0.5vl/100vl,DTT1.5vl/100vl。制作平板膠：分離膠的配制方法：藥品/濃度5%7.5%10%12.5%15%丙烯酰胺6.7ml10ml13.3ml16.7ml20ml分離膠緩沖液10ml10ml10ml10ml10ml10XSDS0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml無菌水22.7ml19.4ml16.1ml12.8ml9.5ml10%過硫酸胺*200vl200vl200vl200vl200vlTEMED*13.3vl13.3vl13.3vl13.3vl13.3vl*在灌膠之前加入藥品配制：丙烯酰胺單體儲液：丙烯酰胺60g甲叉雙丙烯酰胺1.6g溶于無菌水中總體積200ml分離膠緩沖液：Trisbasel81.5g溶于750ml無菌水中調(diào)PH8.8總體積1000m