CAR-T細(xì)胞治療質(zhì)量控制淺談

CAR—T細(xì)胞治療質(zhì)量控制淺談細(xì)胞治療，將改變?nèi)祟惣膊〉闹委煼妒?，由過去重復(fù)的癥狀控制轉(zhuǎn)為一次性的治愈是引領(lǐng)生物醫(yī)學(xué)的希望。其中，嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法是近年來發(fā)展非常迅速的一種細(xì)胞治療技術(shù)。目前在全球已有兩款藥物獲得FDA的批準(zhǔn)上市,分別是諾華的Kymriah和凱特的YESCARTA，中國(guó)有多家公司產(chǎn)品進(jìn)入臨床申報(bào)階段，這種療法已成為更多患者的選擇,CAR—T細(xì)胞制造過程符合全球監(jiān)管要求成為廣泛討論的話題。1中國(guó)正衽申報(bào)臨床的I南示傳奇生物科技科濟(jì)生物制藥藥明巨諾重慶精準(zhǔn)醫(yī)療上海叵潤(rùn)達(dá)生復(fù)星凱特北京藝妙神州科技上海優(yōu)卡迪生物中源協(xié)和北京馬力喏生物博生吉醫(yī)藥科技恒瑞源正生物細(xì)胞治療質(zhì)量控制分析其中細(xì)胞質(zhì)量控制貫穿CAR-T從研發(fā)到臨床的所有步驟，但CAR—T作為“活”的藥物，其很多特性與傳統(tǒng)藥物有很大的差別，下表列舉了與傳統(tǒng)藥物的主要差異點(diǎn)：組成成分致性保質(zhì)期/穩(wěn)宦性生產(chǎn)分析方法細(xì)胞治療產(chǎn)品明確的組成成分組成成分致性保質(zhì)期/穩(wěn)宦性生產(chǎn)分析方法細(xì)胞治療產(chǎn)品明確的組成成分明確的組成成分可能含有不同的細(xì)胞類型批次少批次少（亡口站明確）自休治療,一個(gè)病人?f批次4°C以下可以穩(wěn)定數(shù)月或數(shù)年K弋可以穩(wěn)左數(shù)年24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定』長(zhǎng)時(shí)間保存*需要低于130°C全球布周生產(chǎn)全球布局生產(chǎn)保質(zhì)期眼制*一般當(dāng)?shù)嘏．a(chǎn)主要是物理化學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)主要是物理化學(xué)和PCR及瞬膠電泳主雯是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第一個(gè)上市的CAR-T藥物Kymriah的釋放標(biāo)準(zhǔn)涉及到多個(gè)方面的指標(biāo)，下圖是小編收集到的Kymriah的釋放指標(biāo)所需要測(cè)試的實(shí)驗(yàn)：TitbitKYMRJAHLot冒亡懇毎TestRequir^meiitsfurcommercialuseSampleufiedf(?rtellingAppearanceColorleMtos3sghtlyyellowForm11late(1product(b)(4)IdentitybyCARq-PCKPositiveforPCR.signal(b)⑷■Pert少也雛of訴址沁Tedl右<b)(4)Finalproduct(b)(4)DeterniinatinnoftransductionefficientbyCAR-q-PCR(t>)(4)(b){4)saCellviability(b)(4)Finalproduct(b)(4)Determinattonofresidua.]beadsbymi^mscnpy(b)⑷(b)(4)■Percentageof\iaNcCD19中Bcelk何糾Finalpmducl(b)(4)TotalcellCdunHReportoelis/mLFinn]product(b)(4)Numberoftnablecells(calculated)(b)(4)totalviablecellsFin^lproduct(b)(4)Dose(calenlated]62to弘cxio6CARpositiveviableTcells/bodyweightk囂j0,]to2.5xioflCARpositiveviableTcellst>50kg)FinalpruJucL(aHerthaw)1Calcdationformula；(%VAR唧YiwiGnxViablemWcoh詫玳mioNxVoiitmcperdo雜站rg(perpatients(弐典kgthiaftuiniierisdiuidedperKybod甘u.rei(fhl)DetenHiBatioELctfCARex卩rcssiflnhy打仃殆’(ytomctryFinalproduct(b)(4)ReleaseofIFNyonreaponseCD19-expressingtargeteeHs■1t(b)(4)J⑹⑷Finalproduct(b)(4)ractcri^ilEndotoxins⑼(4)Finalpr()clud(b)(4)SterilityNegiliv-6(4)Mycoplajsma(b)(醴1DeterminationofVSV-GDbJA五yquantitativePCR(qPCR)(b)⑷(b)(4)■KITE的丫ESCARTA的質(zhì)量控制也涉及到非常多的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，篇幅有限，就不一-列舉了，具體指標(biāo)可參考如下的鏈接：https:〃/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM584335。pdf

另一方面CAR—T制造工藝復(fù)雜，下圖列舉了CAR—T的制作流程，其中涉及到病毒轉(zhuǎn)染，外源物質(zhì)的引進(jìn)，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)等因素，這勢(shì)必對(duì)質(zhì)量控制提出了巨大的挑戰(zhàn).MolecularTherapy—Oncolytics(2016)16015細(xì)胞治療質(zhì)量控制原則及法規(guī)基于以上原因，CAR-T細(xì)胞質(zhì)量控制特別強(qiáng)調(diào)制備工藝的穩(wěn)定性、多批次驗(yàn)證、全程質(zhì)控和按照SOP嚴(yán)格操作。要建立穩(wěn)定的質(zhì)量檢驗(yàn)和放行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

美國(guó)和歐洲出臺(tái)了相應(yīng)的法規(guī)來規(guī)范細(xì)胞治療的質(zhì)量控制，以下是國(guó)外針對(duì)細(xì)胞治療出臺(tái)的相關(guān)政策法規(guī)：FD扎GuidanceforIndustry：GuidsnceforHlumanSomaticC?llTh電ippyandGeneTherapy（RDckvilltjMD.Mar.1998）.FDA,Guidenc#forIndustry：SwpplemenUllGuidanceonTestingforReplicationiCompetentRetrovirusinRfltrcviralVictorBa^edlGeneTherapyProdwctssandDuringFollow-upofPatientsin11initialTrialsUsingRetroviralVectors(Rockville,MUNov.200&)-FDA.GuidanceforFDAReviewersandSponsors;ContentandReviewofCherni5tryrManufacturing,andControl(CMC)InformationforHumanSoniiaticCellTherapyInveBtigationalNewDrugApplii匚zticm占(INDe)(R□匚kville,MD.Apr.2008).FDA^GuidanceforIndustry：PotencyTestsforCellularandGeneTherapyProducts(Rockville,MD.Jan.2011).FDA,GuidanceforIndustry：Pirecliniica)AssessmentofInves-tigationalCelliul^randGeneTherapyProducts(RockvilleMDrNov.2012),USP.USPGeneralChapter<1046>,"CellandG?n?TherapyProducts"(Rockville.MD,2011).EMA.GuidelineonDevelopmentandManufactureofLentiviralVectors[London^May2005)-EDQM.EurPhjGeneTransferMedicinalProductsforHucnaniU&e5.14(EDQM.Strasbourg.France,2010]..(大家如有需要,可至文末掃碼下載)在我國(guó)，細(xì)胞治療的國(guó)家主管部門是國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)(NHFPC)和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA),下圖是我國(guó)針對(duì)細(xì)胞治療出臺(tái)的相關(guān)政策法規(guī)：成人的侔細(xì)胞治療屋基因泊抒臨床研究盛控要點(diǎn)》因治抒申報(bào)臨庸試嵋指導(dǎo)原則伊1993.51湖.4《醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法》瓦人體細(xì)胞泊療硏究和制劑質(zhì)左控制技術(shù)的指導(dǎo)2003^成人的侔細(xì)胞治療屋基因泊抒臨床研究盛控要點(diǎn)》因治抒申報(bào)臨庸試嵋指導(dǎo)原則伊1993.51湖.4《醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法》瓦人體細(xì)胞泊療硏究和制劑質(zhì)左控制技術(shù)的指導(dǎo)2003^祇首批光許臨床應(yīng)用的第三類醫(yī)療技術(shù)冃錄3去于即發(fā)干細(xì)胸臨味研究笆理辦法（試行〉的謹(jǐn)知治療產(chǎn)品硏究與評(píng)階技術(shù)抬導(dǎo)虛則〔試行）$C按新菊進(jìn)行笆理）成圉冢衛(wèi)生計(jì)主餐關(guān)于取消第三裘醫(yī)療技術(shù)臨岸引用準(zhǔn)入審批有關(guān)工作的通知陥SOO^.3500S.5200^.6201&.G4015.75015.81017.12《自悴免疫姻腕廿細(xì)胞、NK《自悴免疫姻腕廿細(xì)胞、NK細(xì)腿〕泊抒技術(shù)管岬規(guī)范￡征求意見?！怠窇俑杉?xì)胞臨床詡究背理為法矗和瓦干細(xì)胸制劑質(zhì)Z控制21臨康前硏究扌旨導(dǎo)原則｛試f亍】＞以下以CTL019為例來分析細(xì)胞治療質(zhì)量控制策略，目前細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制分為四個(gè)大的方面，分別為安全性（Safety），純度（Purity），潛能性（Potency）以及均一性（Identity）,這些質(zhì)量控制會(huì)貫穿CAR—T生產(chǎn)的不同階段，下圖列舉了這些檢測(cè)會(huì)在不同的階段開展.

0ODB003000_MailefCell妙k(MCB)00000Vjrvs歸祁^MVBiWVB}陽fki呷CtllBank(WCB)Pr&CW(Grij^IVRodLKlnn/McxIificdlbOfi)□vugSutet^nc#MvnMirWpp^Dr%>gPfflduct■QMK鐐BioReliancetrSAK0ODB003000_MailefCell妙k(MCB)00000Vjrvs歸祁^MVBiWVB}陽fki呷CtllBank(WCB)Pr&CW(Grij^IVRodLKlnn/McxIificdlbOfi)□vugSutet^nc#MvnMirWpp^Dr%>gPfflduct■QMK?無竄.內(nèi)畝素r支原體??無竄.內(nèi)畝素r支原體?眈刪，雷檢界栓遼■衆(zhòng)寶且堆旳?匸吋刪?甌岀規(guī)期a‘主”尸收.家址堆攏訪巍據(jù)?畑電活率CD45tCD3+-ftfflfMM(FACS)*匚丸R在―扯腕表面表這量(:AC5)CRE轉(zhuǎn)迥效室rnRN體平(qPrR)?娩余8汕扯測(cè)(ELI5A)?雀余陋珠檢測(cè)4殘余腫ASH(CEJ4S+CD3-CD15+Frd'entityrtrene!tl,njj檢測(cè)(FACE)?細(xì)胞it敦、戈小、活率?-細(xì)胞佛鑒產(chǎn)(:AC：］?絡(luò)胞因子釋放和反應(yīng)件?再剽散后細(xì)胞土丘速靈測(cè)試檢測(cè)/UCD1?表迖的吧帝細(xì)胞功能愷測(cè)F【:^entity■trengitfj?c/.RFFrSBS表直表遲呈(facs)?匚削轉(zhuǎn)染逐血麗水平｛；|PCR)?細(xì)胞很度(全口動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)牧)?毎干克煤豆HR表1ST整胞剤環(huán)計(jì)算生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用于質(zhì)量分析帶來的挑戰(zhàn)在這些實(shí)驗(yàn)中，大部分是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，生物學(xué)實(shí)驗(yàn)因?yàn)椴僮鞣椒ǎ瑯颖静町惖纫蛩貢?huì)給結(jié)果帶來較大的波動(dòng)，也給這些方法向GMP轉(zhuǎn)移帶來了挑戰(zhàn)，同時(shí)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范難以制定，以CAR-T的轉(zhuǎn)染效率測(cè)定為例，不同的人對(duì)流式細(xì)胞儀結(jié)果設(shè)門得到的差異會(huì)有較大的差異.53dld幺ICPCIO3TG53dld幺ICPCIO3TG31護(hù)4聲SA-PEPE-A細(xì)胞治療質(zhì)量控制的基石實(shí)驗(yàn)一濃度，活率細(xì)胞濃度活率測(cè)試方面，其是很多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，比如細(xì)胞生長(zhǎng)速率測(cè)定，細(xì)胞因子檢測(cè)，細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)檢測(cè)方面，細(xì)胞計(jì)數(shù)是這些實(shí)驗(yàn)的第一步，這一步如果錯(cuò)誤，那么結(jié)果波動(dòng)大是預(yù)料之中的。另外在在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，極為重要的一點(diǎn)是優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件?細(xì)胞的濃度，活率，結(jié)團(tuán)率形態(tài)是了解反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)?總而言之，CAR-T從細(xì)胞收集開始到最后的產(chǎn)品回輸，濃度活率一直是最關(guān)鍵的指標(biāo)之一?既然濃度活率對(duì)于CAR—T整個(gè)生產(chǎn)過程這么的重要，小編自作主張的調(diào)研和試用了市場(chǎng)上最暢銷的幾款細(xì)胞計(jì)數(shù)儀尤其衷愛我國(guó)自主研發(fā)生產(chǎn)的CountstarRigel熒光細(xì)胞分析儀。不得不說，這款產(chǎn)品的智能、精準(zhǔn)、合規(guī)滿足了小編對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀所有的想象。智能作為新時(shí)代年輕人，觸屏的使用已經(jīng)深入人心，這款產(chǎn)品的設(shè)計(jì)也讓小編有告別傳統(tǒng)PC時(shí)代，與科技進(jìn)步共發(fā)展的認(rèn)同感。只需動(dòng)一動(dòng)手指，即可全自動(dòng)獲得細(xì)胞分析結(jié)果和圖像。高質(zhì)量的圖像可通過多點(diǎn)觸控放大或縮小，讓你看得真切，讓小編對(duì)結(jié)果的真實(shí)性不再懷疑。三分鐘檢測(cè)五個(gè)樣，用這樣的神器，老板再也不用擔(dān)心我的計(jì)數(shù)速度啦。正是這款小小的熒光細(xì)胞分析儀其實(shí)具有大智慧?除細(xì)胞濃度活率檢測(cè)外，對(duì)于CarT細(xì)胞中效應(yīng)細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡等測(cè)試這款儀器也能進(jìn)行很好的分析。AO/PIS$缺嬋AO/PIS$缺嬋細(xì)胞遍亡細(xì)鬼麗CDMarkEr^^r精準(zhǔn)小編親測(cè)，使用AOPI活率檢測(cè)程序測(cè)試細(xì)胞濃度和活率，看一遍即會(huì)使用,5槽測(cè)試結(jié)果CV<5%，線性R2>0。99,多臺(tái)儀器間測(cè)試結(jié)果一致。多個(gè)地區(qū)，多類樣品，多個(gè)人開展測(cè)試，也不再擔(dān)心數(shù)據(jù)的一致性.CountstarRigel的AOPI細(xì)胞活率測(cè)試，可用于全血的質(zhì)量評(píng)估,PBMC分離效率檢測(cè)，T細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)，T細(xì)胞的增殖率和活率，產(chǎn)品釋放質(zhì)量控制，在CarT細(xì)胞治療整個(gè)質(zhì)量控制過程均可使用。撫取樣#址謝修怖撫取樣#址謝修怖合規(guī)從美國(guó)藥典，F(xiàn)DA以及CFDA的法規(guī)來看，對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品用于藥品，符合GMP規(guī)范進(jìn)行管理成為未來的趨勢(shì)。所以，小編對(duì)儀器最重要最基本的要求就是需要符合GMP/cGMP、數(shù)據(jù)審計(jì)追蹤、FDA21CFRPARTll.CountstarRigel從設(shè)計(jì)到服務(wù)完全符合這個(gè)要求！同時(shí),CountstarRigel提供標(biāo)準(zhǔn)微珠顆粒、3Q驗(yàn)證服務(wù)，并且