酵母分離培養(yǎng)

YPD培養(yǎng)基YPD或YPED,:YeastExtractPeptoneDextroseMedium（1L）,又叫酵母浸出粉胨配方：1%YeastExtract（酵母膏），2%Peptone（蛋白月東） ，2%Dextrose（glucose）（葡萄糖），若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉配制方法：.溶解10gYeastExtract（酵母膏），20gPeptone（蛋白東），20g瓊脂粉于900ml水中.高壓115度20min3.加入100ml10xDextrose（glucose）（葡萄糖），（葡糖糖溶液滅菌后加入）,注：葡萄糖，yeastextract,peptone溶液混合后在高溫下可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基成分變化，所以要分別滅菌后再混合。1、 接種：取酵母0.5克，加入到5ml的YPD培養(yǎng)液中，在30°C搖床中過夜培養(yǎng)，可見培養(yǎng)液變渾濁。2、 計(jì)數(shù)：將酵母菌液稀釋到合適的倍數(shù)（約102-103倍）以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度，涂于血球計(jì)數(shù)板上，在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)酵母菌數(shù)。3、 涂皿：將培養(yǎng)基溶化后制成平板，用無菌吸管取0.1ml稀釋合適倍數(shù)的菌液到平板中，用涂棒涂勻后培養(yǎng)24h。做平行樣。4、 分離純化：用接種環(huán)挑取單個(gè)酵母菌菌落，在平板上三區(qū)劃線，培養(yǎng)后分離得到單個(gè)菌落。5、 鏡檢：挑取單菌落，制片觀察其形態(tài)。6、 菌種保藏：接種酵母菌到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，長出菌苔后冰箱保藏。血球計(jì)數(shù)板使用取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。將菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液，然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血球計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央1個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入相應(yīng)的格中。對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），按公式計(jì)算出每mL（g）菌懸液所含細(xì)胞數(shù)量。測(cè)數(shù)完畢，取下蓋玻