第7章親和層析課件

第七章 親和層析9/16/20231Affinity

chromatography技術(shù)背景9/16/20232一般純化蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的方法的主要依據(jù)是，各種大分子之間理化特性的差異性。如果這種差異性較小，要得到一種純度稍

高的物質(zhì)，常常需要進(jìn)行多次繁瑣的操作，耗費(fèi)較長的時(shí)間，但最終收得率卻是很低。9/16/20233內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 操作第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例9/16/20234第一節(jié) 基本原理蛋白質(zhì)2與配體無生物學(xué)特異性12L9/16/20235MS親和層析的概念親和力

根據(jù)生物體中高分子化合物能與之相對應(yīng)的專一分子特異識別和可逆結(jié)合的特征,將生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力.親和層析法

利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性吸附而進(jìn)行選擇性分離的一種生物大分子分離的層析方法。親和層析法的實(shí)質(zhì)

是在載體(無機(jī)或有機(jī)填料)的表面先鍵和一種具有一般反應(yīng)性能的間隔臂,隨后再連接配體（酶、抗原、激素等）組成固定相,而固載的配體高選擇地吸附與其有生物特性的大分子而被保留,非特異的分子不被保留先流出層析柱,保留在柱上的分子將以態(tài)洗脫下來。9純/16/品202形369/16/20237親和層析法的作用機(jī)理：固相載體(1)(2)(3)WashingElutionXBSampleB親和基團(tuán)配體XABAA9/16/202389/16/20239特異性配體親和層析法和通用性配體親和層析法：方法配體性能特異性配體親和復(fù)雜的生命大分子具有較強(qiáng)的吸附選層析法物質(zhì)（如抗體、受擇性和較大的結(jié)合體和酶的類似底物力等）通用性配體親和層析法9/16/2023簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料、以及氨基酸等）成本低廉，具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率

10親和層析的特點(diǎn)：柱層析柱小

Vt＝1～1.5ml。上樣量大,達(dá)

1/2Vt體積并對樣品的濃度與純度要求不高。操作簡單,時(shí)間快速。柱子填充載體昂貴,配體的特異性,有時(shí)找不到適宜的配體,不適合所有生物大分子樣品。條件溫和:不影響樣品的生物活性,適合生物大分子的操作。純化效率高:一步法分離和

純化混合物中的樣品,提純

達(dá)幾千倍,得到高純度樣品。選擇性強(qiáng):依據(jù)生物學(xué)特異性,而非物理化學(xué)性質(zhì)分離原理.故特異的層析圖為2個(gè)峰,第1個(gè)為雜峰,第2峰9為/16/純2023品。11Activity典型的親和層析操作：Elution

volumeProteinpH2.05*9/16/202312親和層析的特點(diǎn)：柱層析柱小

Vt＝1～1.5ml。上樣量大,達(dá)

1/2Vt體積并對樣品的濃度與純度要求不高。操作簡單,時(shí)間快速。柱子填充載體昂貴,配體的特異性,有時(shí)找不到適宜的配體,不適合所有生物大分子樣品。條件溫和:不影響樣品的生物活性,適合生物大分子的操作純化效率高:一步法分離和純化混合物中的樣品,提純達(dá)幾千倍,得到高純度樣品選擇性強(qiáng):依據(jù)生物學(xué)特異性,而非物理化學(xué)性質(zhì)分離原理.故特異的層析圖為2

個(gè)峰,第1個(gè)為雜峰,第2峰9為/16/純2023品13內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 操作第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例9/16/202314第二節(jié) 操作9/16/202315一、理想基質(zhì)的性質(zhì)結(jié)構(gòu)是松散的多孔網(wǎng)絡(luò)，利于大分子的流動與滲透；顆粒均勻的球形，剛性好,不易溶性，操作壓的變化不引起變形；物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；化學(xué)性質(zhì)是惰性，以降低非特異性的吸附；帶有豐富的化學(xué)基團(tuán)易活化，以結(jié)合較多的配體；高度親水性，易與水溶液中的生物大分子結(jié)合；抗微生物和酶的侵蝕。具有實(shí)用價(jià)值的基質(zhì)纖維素：用于抗體與酶的純化，如分離酪氨酸酶，酪氨酸酶的抑制劑連接到纖維素上，一步將酶純化幾百倍。

但其纖維性及非均一性限制了大分子的滲入;有非專一性吸附。葡聚糖凝膠：良好的化學(xué)及物理穩(wěn)定性，多孔性的結(jié)構(gòu)利于生物大分子的分離。但其膨脹度變化大，應(yīng)用受限制。聚丙烯酰胺凝膠：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，抗微生物侵

蝕,可提供很多供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基，提高配基的濃度。適合于配基和親和物之間親和力較弱的系統(tǒng)。但9/16/不2023易引入間隔臂，受到限制。16其它實(shí)用性基質(zhì)多孔玻璃：不受微生物的侵蝕，對有機(jī)溶劑和緩沖液的組成改變不敏感。保留表面含有羥基，在水溶液中顯輕微負(fù)性的表面電荷，對酸性蛋白，病毒，多糖或核酸沒有阻擋和吸附，而可以吸附所有的強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)和一些中性蛋白質(zhì)及病毒。瓊脂糖：商品為Sepharose

2B,4B,6B表示2，4和6％的瓊脂糖濃度的珠狀凝膠。其化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定性弱于葡聚糖和聚丙烯酰胺，熱穩(wěn)定性差，在pH4－9的環(huán)境使用，在一定濃度的酸堿不導(dǎo)致凝膠顆粒的變化，不被有機(jī)溶劑（乙醇，丙酮）引起收縮，能經(jīng)受高濃度變性劑而不9改/16/2變023其吸附性能，故實(shí)用性廣。17二、配基（配體）的選擇9/16/202318任何大分子或小分子蛋白、核酸（或其他分子）有特異結(jié)合的都可以作為配體；配體是有一定局限性，只能特異性地與某一種物質(zhì)結(jié)合，而這種結(jié)合是可逆的，利用此性質(zhì)可提取、純化與配體特異結(jié)合的物質(zhì)。1.配體的選擇9/16/202319優(yōu)良的配體必須具備兩個(gè)條件：配體與生物大分子具有合適的親和力;配體具有與載體牢固地結(jié)合,又不影響與生物大分子之間的親和力。配體的選擇固定在固相載體上的配體具有與目的蛋白能夠選擇性地結(jié)合并形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力。復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于配體與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)之間結(jié)合的緊密程度。足夠強(qiáng)的結(jié)合要求配體能夠精確的嵌合在結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。解離常數(shù)的范圍在10-5～10-8/M時(shí)適合于親和層析過程。當(dāng)解離常數(shù)﹥10-3

時(shí)，配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合力較弱，在層析過程中拉不牢目的蛋白，選擇性過低;當(dāng)解離常數(shù)

＜10-15

時(shí)，親和力太大，洗脫時(shí)得用激烈的和苛刻的、甚至是變性的條件。9/16/這2023對分離生物活性樣品是忌諱的。202.配體的分類單特異性配體：只結(jié)合一個(gè)或很小數(shù)量的蛋白質(zhì)，識別小分子的局限性強(qiáng)，甾體激素和酶抑制劑屬于此類配體大分子單特異性配體：抗體－抗原結(jié)合是大分子單特異性配體及其目的蛋白的最重要的例證。組特異性配體（通用性配體）：是指一類像輔酶、維生素/輔因子或它們的類似物，它們可以同幾種不同蛋白的共同位點(diǎn)相結(jié)合。是識別一類小分子物質(zhì)的配體。大分子組特異性配體:是識別一類大分子物質(zhì)的配體。凝集素和一些免疫球蛋白結(jié)合蛋白、伴刀豆球蛋白與糖蛋白結(jié)合等。9/16/2023

21專一性結(jié)合的生物體系常用配體分離對象酶蛋白基質(zhì)類似物、抑制劑、輔酶、底物、產(chǎn)物等抗

體抗原、病毒、細(xì)胞外源凝集素多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、結(jié)合蛋白核

酸互補(bǔ)堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、結(jié)合蛋白激素及維生素受體、載體蛋白9細(xì)/16/2023胞細(xì)胞表面特異性蛋白、外源凝集素

22蛋白質(zhì)親和層析中的合適配體配體待純化的蛋白質(zhì)配體待純化的蛋白質(zhì)抗原特定單克隆抗體或多克隆抗體肝素凝聚因子、脂酶、結(jié)締組織蛋白酶、DNA聚合酶單克隆抗體特定抗原膽固醇膽固醇受體、膽固醇結(jié)合蛋白蛋白質(zhì)A/蛋白質(zhì)G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸鹽糖蛋白三嗪染料脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素凝集素糖蛋白9抗/16生/20物23素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶239/16/202324三、親和吸附劑的制備一般用CNBr衍生載體的功能基團(tuán)，產(chǎn)生的親電基團(tuán)可以同配體的親核基團(tuán)（-NH2,-SH，－OH）反應(yīng)?；蛘呦喾?。用物理與化學(xué)的方法把配體偶聯(lián)到基質(zhì)上。化學(xué)偶聯(lián)法是通過配體對活化的載體材料進(jìn)行親核攻擊實(shí)現(xiàn)的.測定配體結(jié)合量，每mL或每g載體束縛配體的量mg（mg/mL）。一般用直接法和間接法測定。法載體的活化配體的偶聯(lián)結(jié)合能力的測定9測/16/定202方325溴化氰（CNBr）環(huán)氧氯丙烷1,4-丁二醚戊二醛高碘酸鹽9/16/202326活化劑種類常見幾種活化劑的活化條件9/16/202327活化劑溫度/℃pH值時(shí)間/min溴化氰41010-30環(huán)氧氯丙烷45-56131201,4-丁二醚5013120載體的偶聯(lián)條件9/16/202328pH：最佳pH在8-10之間緩沖溶液：碳酸氫鈉、硼酸鹽，不能用Tris和其他含氨基的緩沖液溫度和時(shí)間偶聯(lián)配體濃度：每毫升凝膠選用配體1-20umoL不同活化劑活化載體的偶聯(lián)條件9/16/202329活化載體溫度/℃pH值時(shí)間/h溴化氰活化載體49.524環(huán)氧氯丙烷活化載體409.5241,4-丁二醚活化載體459.530用溴化氰活化載體9/16/2023309/16/202331四、特異性吸附欲分離物質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合，當(dāng)結(jié)合量較強(qiáng)時(shí)，配體與有效成分緊密結(jié)合，隨著樣品的加入，親和成分恒定增加并不斷地吸附上柱，形成致密

的復(fù)合物帶，使吸附容量增至最大，達(dá)到飽和。

影響吸附容量除親和力外和還與pH、離子強(qiáng)度有

關(guān)。例：P120復(fù)合物帶9/16/202332樣品中有效成分在親和吸附劑上的吸附量，除了與它們之間的親和力有密切關(guān)系外，還與樣品的pH值和離子強(qiáng)度有關(guān)系。9/16/202333五、層析步驟柱子再生結(jié)合步驟 裝柱操作凝膠與配體偶聯(lián)洗脫方法 淋洗9/16/202334樣品制備選擇配體流速控制柱子平衡洗脫目標(biāo)樣品1.樣品制備9/16/202335除去顆粒、細(xì)胞碎片、膜片段等；樣品的濃縮、除去蛋白酶及其抑制劑；可以通過鹽析方法沉淀雜蛋白或離子交換層析法對樣品進(jìn)行預(yù)處理。2.結(jié)合吸附條件目標(biāo)蛋白質(zhì)對配體的特異性結(jié)合需要最適合的pH、緩沖液鹽濃度、離子強(qiáng)度、溫度。pH起著調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子以及配體分子的電荷基團(tuán)性質(zhì)的作用。中等鹽濃度（0.1～0.15mol/L

NaCl）可以穩(wěn)定溶液中的蛋白質(zhì)并防止非特異性的作用。高鹽濃度（2mol/L(NH4)2SO4）能特異性地提高配體和靶蛋白的疏水作用。EDTA(10mmol/L)用以穩(wěn)定蛋白質(zhì)中能被重金屬

化氧化的－SH基。9/16/2023363.柱操作9/18/202337選用柱的大小依據(jù)a.吸附劑的容量；b.需要純化的蛋白質(zhì)的量。由于親和原理，可分離的容量大。樣品量可達(dá)柱體積。為提高分離效率，一般選用粗、短柱?？傮w積只需1～5ml。若靶蛋白是較低的結(jié)合常數(shù)﹥10-4/M可用較長的柱，結(jié)合較牢、結(jié)合常數(shù)＜10-13

/M則選用短柱。124.

柱流速的控制在概念上，親和層析的流速比較快，要求不嚴(yán)格。但為了使純化的蛋白質(zhì)能得到尖的洗脫峰和最小的稀釋度及最大的回收率。故上樣品時(shí)使用低流速。太高的流速會降低分離效果和容量；用可溶性配體/類似物進(jìn)行競爭性洗脫時(shí)，解離動力學(xué)可能成為速率限制；親和柱的線性流速需進(jìn)行優(yōu)化達(dá)到最大的結(jié)合容量和最佳的分離。9/18/2023385.洗脫方法9/18/202339大體積的平衡緩沖液洗脫親和力較小的分子；親和力稍大時(shí)，線性梯度、階梯分步洗脫；可改變pH、離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)非特異性的競爭，解吸已結(jié)合的分子；對親和力特別大的復(fù)合物，除用高濃度的可溶性配體洗脫外，還需6mol/L鹽酸胍、pH1.5，使復(fù)合物在合理的時(shí)間內(nèi)解離。并不破壞靶蛋白的天然構(gòu)象及生物活性。以及洗脫后的除鹽。①用NaCl梯度洗脫特異的靜電作用結(jié)合的蛋白質(zhì)；②疏水結(jié)合的復(fù)合物，加入乙二醇降低水溶液的極性；③9用/18/2變023性劑解離疏水結(jié)合的復(fù)合物。40A.特異性洗脫：9/18/202341凡是能與配體競爭酶的游離配體，都十分強(qiáng)烈地影響著結(jié)合酶的洗脫過程。游離配體濃度若與配體濃度相同，則可直接從基質(zhì)上洗脫小結(jié)合的酶。同時(shí)應(yīng)根據(jù)酶與配體親和力的大小確定洗脫液的濃度。B.非特異性洗脫：通過改變洗脫液的條件（pH、離子強(qiáng)度、溫度℃和介電常數(shù)），即能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，降低蛋白質(zhì)與配體的親和力、不損害蛋白質(zhì)與吸附劑的穩(wěn)定性。6.洗脫步驟9/18/202342淋洗樣品吸附上柱后，須用幾倍體積的起始緩沖液淋洗柱子，去除所有不結(jié)合的物質(zhì)，非特異性結(jié)合的成分可用稍微增加離子強(qiáng)度的條件除掉。洗脫為使靶蛋白在最小的體積內(nèi)回收，其生物化學(xué)性質(zhì)保持不變?；痉椒ㄊ怯弥械葷舛龋?.2～1mol/L）的可溶性配體或類似物在溫和條件下（中性pH）競爭性的結(jié)合蛋白。7.親和層析柱的再生9/18/202343當(dāng)洗脫結(jié)束后，應(yīng)連續(xù)用大量的洗脫液或高濃度的鹽溶液徹底洗滌柱子，接著再用平衡緩沖液使層析柱重新平衡。經(jīng)過這樣處理的柱子可再次上樣，進(jìn)行第二次親和層析。一般親和層析柱都可以反復(fù)使用多次。內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 操作第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例9/18/202344第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量9/18/202345親和吸附劑的操作容量，受以下因素的影響：配體性質(zhì)配體在吸附劑中的含量配體與吸附物結(jié)合時(shí)的位阻效應(yīng)大小基質(zhì)的多孔性操作條件等一、引入間隔手臂9/18/202346親和層析中經(jīng)常使用小分子化合物作為配體制備親和吸附劑，但小分子配體直接連接于瓊脂糖上產(chǎn)生無效吸附劑，其原因是由于載體的空間位阻關(guān)系，使大分子化合物（親和物）不能直接接觸到配體。因此，通過在載體與配體之間引入適當(dāng)長度的“手臂”減少載體的空間位阻，增加配體的活動度。常見的間隔臂是6～8個(gè)碳原子的碳?xì)滏湥|(zhì)到配體的長度為0.5～1nm；或用長達(dá)17個(gè)碳原子。9/18/202347間隔臂:不同長度的間隔臂（B＝1nm）(C=2.1nm)對靶酶的親和力的差異對氨基苯-β-硫代吡喃半乳糖苷9/18/202348氨乙基乙酰胺間隔臂的分類疏水間隔臂親水間隔臂大分子間隔臂間隔臂與配體的偶聯(lián)1.

親核基團(tuán)（氨基、硫醇、羥基）；親電子基團(tuán)（還亞胺碳酸、還氧乙烷、重氮鹽、酚、芳香胺及活性羰基）。通用配體：腺嘌呤和核苷酸輔酶：用于純化各種激酶、脫氫酶。多核苷酸：純化與其親和的蛋白質(zhì)、酶、動物病毒和病毒的RNA序列及互補(bǔ)的聚核苷酸。輔酶：用于純化親和性的各種酶類。9/18/202349二、增加配體取代的程度基質(zhì)的活性基團(tuán)增多，配體結(jié)合量增加，操作容量亦大；由于位阻效應(yīng)而影響配體的偶聯(lián)量，故控制偶聯(lián)反應(yīng)的條件可增加配體的偶聯(lián)數(shù)量。9/18/2023509/18/202351三、減少結(jié)合鍵增加配體與蛋白質(zhì)的互補(bǔ)效應(yīng)9/18/202352以蛋白質(zhì)與多肽為配體時(shí)，以最少的共價(jià)鍵連接至載體，利于保護(hù)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及生物活性；控制偶聯(lián)反應(yīng)的pH，減少蛋白質(zhì)分子與基質(zhì)連接的鍵；位點(diǎn)的減少，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)，提高結(jié)合容量。四、殘留活化基團(tuán)的封閉封閉多余的活化基團(tuán)，避免非特異性吸附。結(jié)

論親和層析一般采用柱層析方法；親和柱的平衡緩沖液的組成、pH、離子強(qiáng)度；選擇親和物雙方作用強(qiáng)，有利于形成絡(luò)合物的條件；最緊密的絡(luò)合物不容易解離，應(yīng)考慮避開某些條件；選用近中性pH為親和吸附條件，上樣液與柱平衡液一致;避免生物大分子的失活，親和吸附可在4℃進(jìn)行；增加吸附容量，上樣品速度盡量慢；用大量的平衡緩沖液洗去雜質(zhì)，及非專一性的吸附，柱上保留專一的親和樣品；和力，使絡(luò)合物完全解離。

9/18洗/202脫3液的條件與吸附條件相反，減弱配體與蛋白的親53內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 操作第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例9/18/202354第四節(jié) 應(yīng)用A.不保留峰

B.脫附峰縱坐標(biāo)示吸收值

橫坐標(biāo)示洗脫體積親和層析的基礎(chǔ)是對蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性的吸附－

脫附，一般的結(jié)果是層析圖譜上出現(xiàn)二個(gè)層析峰，不保留峰與脫附峰，脫附動力學(xué)一般較慢，脫附VeAB9/18/20的23

層析峰寬而拖尾。55親和層析應(yīng)用9/18/202356一、純化特異性生物分子純化抗原、抗體及其結(jié)合物；分離糖蛋白、各種凝集素；含巰基蛋白質(zhì)的分離；用寡聚核苷酸分離核酸；凝集素配體結(jié)合膜蛋白的分離技術(shù)。親和吸附劑：基質(zhì)－－間隔臂－－抗體(抗原)組成,用于鑒定、分離、純化樣品中的抗原(抗體)1.抗原、抗9/18/202357體的純化Protein

A對IgG類物質(zhì)有較大的束縛力，加之免疫球蛋白被束縛之后仍保留了IgG束縛抗原的特性。所以利用結(jié)合IgG的Protein

A-Sepharose

CL-4B吸附劑還可分離特異性的抗原。9/18/202358免疫親和層析小鼠血清不同亞型IgG 的分離1m1的A蛋白Sepharose

CL-4B柱用1.5mol/L的甘氨酸-NaOH，pH

8.9的緩沖液(內(nèi)含3mol／L

NaCl)平衡↓5m1小鼠血清同等體積的平衡液稀釋后上柱↓洗去不吸附的蛋白質(zhì)↓用不同pH的0.1mol/L檸檬酸洗脫9/18/202359

9/18/2023602.純化糖類分子9/18/202361配體為外源凝集素的Sepharose6B的親和層析介質(zhì)，特異地結(jié)合碳水化合物的糖類殘基或糖化細(xì)胞膜組分、細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及糖蛋白等。凝集素和糖蛋白的親和層析分離9/18/202362

凝集素是在自然界廣泛存在的一大類糖結(jié)合蛋白。它們具有不同的糖結(jié)合專一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白，可以有效地分離純化不同型的凝集素，也可應(yīng)用固定化的凝集素分離純化各種糖蛋白。用10mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0，含0.15mol/LNaCl)平衡酸處理的Sepharose

6B(AT-6B)↓天花粉的丙酮粉制劑用平衡液抽提后，上AT-6B柱↓洗去不吸附的雜蛋白↓用0.2mol/L的半乳糖溶液洗脫花粉凝集素9/18/202363ⅰ.用含有半乳糖的天然多糖-瓊脂糖的交聯(lián)產(chǎn)物分離天花粉凝集素

9/18/202364ⅱ.糖蛋白親和層析9/18/202365

不同的糖蛋白具有不同的單相組分和糖鏈結(jié)構(gòu)，它們和不同的凝集素呈現(xiàn)出不同的結(jié)合能力。常用的凝集素

：

Con

A 、LCAWGA對甘露糖專一對N-乙酰氨基葡萄糖專一人血色素結(jié)合蛋白(hemopexin)的分離

用50m

mol/L的磷酸緩沖液，pH7.0(含0.2mol/LNaCl)平衡固定化的WGA柱離子交換層析得到含有血色素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的級分↘↙上柱↓平衡液洗脫不結(jié)合在柱上的轉(zhuǎn)鐵蛋白↓含有100

mg／m1

N-乙酰氨基葡萄糖的平衡液洗脫血色素結(jié)合蛋白回收率達(dá)91％9/18/2023669/18/202367

UUUUUUUUUUUUUUUAAAAAAAAAAAAAAAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA帶PolyU

(T)的親和吸附劑分離含PolyA尾巴的mRNA3.分離核酸AAAAAAAAAAAAAAAAA9/18/2023689/18/202369SDS-PAGE4.以親和層析法純化

Trypsin：Disc-PAGEA

BC

=

DCHOMChitinTrypsinA

B

C&D以凝膠電泳鑒定親和層析9/18/2操023作過程各步驟的樣本→70酶和蛋白類型抑制劑的親和層析9/18/202371

一些酶及其抑制劑間存在著非常專一的相互作用。一些酶的抑制劑被固定化以后，就可用于一些酶的分離純化。一些固定化的酶也被應(yīng)用于蛋白類型的抑制劑的分離。

為了避免位阻現(xiàn)象，在酶類的小分子抑制劑固定化時(shí)，常要插入一些不同長度的“手臂”，如插入

8-9個(gè)原子。5.受體蛋白的純化9/18/202372由于受體蛋白在激素與其互補(bǔ)的膜結(jié)合中的重要作用，同時(shí)其含量極低，使研究受阻。利用親和層析法分離受體蛋白成為可能。例：胰島素受體蛋白的純化：將胰島素偶聯(lián)到溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，結(jié)合受體蛋白，特異性洗脫，釋放出目標(biāo)蛋白質(zhì)。6.重組蛋白

用基因工程的方法引入特殊結(jié)合位點(diǎn)（如金屬結(jié)合位點(diǎn)），將其加在重組目的蛋白的氨基端或羧基端。緊鄰結(jié)合位點(diǎn)的位置加入蛋白酶切割位點(diǎn)，以便在用親和層析純化之后，將多余的蛋白質(zhì)