生物物理技術(shù)論文(新)

磁性納米顆粒的體外細胞毒性評價方

法摘要：納米顆粒能夠滲透到膜細胞中，并沿神經(jīng)細胞突觸、血管和淋巴血管傳播。與此同時，納米顆粒有選擇性地積累在不同的細胞和一定的細胞結(jié)構(gòu)中。納米顆粒的強滲透性為藥物的使用提供了有效性，因此納米材料在醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷、藥物傳輸、癌癥治療、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，同時，納米顆粒對人體健康的潛在威脅也備受關(guān)注，納米毒理學(xué)研究由此應(yīng)運而生。納米材料往往影響細胞的代謝活動，細胞膜的完整性，細胞凋亡和增殖。本文就細胞經(jīng)磁性納米顆粒處理后出現(xiàn)的特征，總結(jié)了幾種常用的毒性評價方法。關(guān)鍵詞：磁性納米顆粒；細胞毒性；檢測方法目錄TOC\o"1-5"\h\z引言1.針對線粒體功能障礙的檢測21.1MTT法21.2CCK-8試劑盒法31.3AlamarBlue法42.針對乳酸脫氫酶泄露的檢測（LDH法）43.針對細胞凋亡的檢測（形態(tài)學(xué)觀察）54.針對細胞壞死的檢測（細胞膜不完整）54.1中性紅染色54.2臺盼藍染色64.3乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠65.針對DNA損傷的檢測（彗星電泳法）6結(jié)論7.參考文獻7引言隨著科技的快速發(fā)展，納米材料因其特殊物理化學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于化妝品、電學(xué)器件、染料、涂料及醫(yī)藥診斷等各個領(lǐng)域［1-3］，尤其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的作用及其顯著，因此而備受關(guān)注，而人們對于納米材料對環(huán)境安全和人體健康所潛在的影響卻知之甚少。因此,納米毒理學(xué)應(yīng)運而生。納米毒理學(xué)是專門研究納米顆?；虿牧隙拘缘膶W(xué)科,運用一系列方法來分析納米材料在體內(nèi)和體外所產(chǎn)生的影響［4］。一般利用體外細胞毒性實驗來進行納米材料的細胞毒性評價,與動物活體實驗相比，體外細胞檢測不會受道德上的束縛，更容易控制和復(fù)制，且花費不高。在研究納米顆粒對細胞的毒性時，值得注意的是，細胞除了對被測試的潛在毒性劑的濃度波動敏感外，它們對所處環(huán)境中溫度、PH、營養(yǎng)物和廢棄物的濃度等的變化也很敏感。因此，為了確保檢測的細胞死亡相對于不穩(wěn)定的培養(yǎng)的條件，與加入的納米粒子的作用相關(guān)，控制實驗條件是非常重要的。此外，由于納米顆?？梢晕饺玖喜⒕哂醒趸€原活性，采用合適的細胞毒性檢測方法也很重要。所以需要進行重復(fù)檢測，以確保得出正確的結(jié)論［5］。磁性納米顆粒對細胞產(chǎn)生毒性影響導(dǎo)致細胞的變化有：炎癥、凋亡小體的產(chǎn)生、線粒體功能障礙、膜破裂導(dǎo)致乳酸脫氫酶的泄露、活性氧的產(chǎn)生、DNA損傷、染色體的濃縮等［6］(圖1)，本文就如何檢測這些毒性作用導(dǎo)致出現(xiàn)的特征對磁性納米顆粒的毒性檢測方法作一簡要綜述,以供大家對納米材料的細胞毒性進行評價時作為參考。OXhufkinniahciiSPIONGeoeratLOiiofR.OSJ「OHQJDNAdmageMembraneleakagebictaleOXhufkinniahciiSPIONGeoeratLOiiofR.OSJ「OHQJDNAdmageMembraneleakagebictale血hydro驢冶uChnamcficnnecotkki^LioiiLmpatreclimtoehondfialfiiucticnApaptoticbodies圖1.納米顆粒的細胞毒性反應(yīng)針對線粒體功能障礙的檢測1.1MTT法MTT比色分析法由Mosmann在1983年首創(chuàng)。MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中(圖2),而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMS0)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比［7］。MTT法被廣泛用于評價多種納米材料的體外細胞毒性。Morteza

等用此法檢測到不同濃度SPION處理下心臟細胞，腦細胞，腎細胞數(shù)量的變化（圖3）[8]這種方法有很多優(yōu)點，靈敏度高，簡單，快速又簡單，但是同時也有諸多缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。生成的甲瓚不易充分溶解。測試后的細胞不能繼續(xù)培養(yǎng)。圖2.線粒體中的琥珀酸脫氫酶使MTT還原為藍紫色結(jié)晶甲臜1.2CCK-8試劑盒法CellCountingKit-8簡稱CCK-8,是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8是一種類似MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體的脫氫酶還原成橙黃色的formazan，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，不需要裂解細胞，可直接進行比色。細胞毒性越大，則顏色越淺。顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。此方法與MTT相比有明顯的優(yōu)點，首先，MTT被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要特定的溶解液來溶解，細胞不可以重復(fù)使用，而WST-8和MTT類產(chǎn)品如XTT、MTS等產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的更易溶解。用CCK一8法檢測后細胞可重復(fù)利用，將細胞用生理鹽水洗2遍，加入培養(yǎng)液可繼續(xù)培養(yǎng)進行傳代，還可進行染色和組化實驗等，而MTT法不具備這一功能［9］?？傊?，CCK一8法顯色時間短、操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，而且檢測后的細胞可重復(fù)利用，具有一定的實用性，可以替代MTT法并廣泛應(yīng)用。1.3AlamarBlue法Alamar-Blue檢測試劑為細胞毒性檢測提供了一種簡便、快速、可靠、安全的方法，適用于高通量檢測實驗。此試劑的主要成分是一種氧化還原指示劑其在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍色無熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，其吸收峰為530—560nm。在細胞增殖過程中，細胞內(nèi)NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細胞內(nèi)的染料被這些線粒體酶還原后釋放到細胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無熒光的靛青藍變成有熒光的粉紅色。最后用普通分光光度計或熒光光度計進行檢測吸光度和熒光強度與活性細胞數(shù)成正比。Alamarblue法對細胞的毒性小，對樣品破壞小、試劑用量少、操作簡單，特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好。具有加入培養(yǎng)液里的細胞生存力不受影響而使培養(yǎng)可以持續(xù)進行等優(yōu)點。Alamarblue法比傳統(tǒng)的細胞計數(shù)法和MTT可更準確地測定細胞的增殖反應(yīng)，且能避免人為操作造成的試驗誤差，提高了試驗結(jié)果的準確性和重復(fù)性，方法安全、簡單、快速［10］。針對乳酸脫氫酶泄露的檢測（LDH法）LDH（乳酸脫氫酶）是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細胞的胞質(zhì)中，正常情況下,LDH不能透過細胞膜，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外。此時培養(yǎng)液中LDH活性與細胞死亡數(shù)目成正比。LDH可使乳酸脫氫，進而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT）,INT接受H+被還原成紫紅色甲臜類化合物。在酶標儀上用490nm比色測定u。用此法檢測了超順磁性納米顆粒等不同納米顆粒對PC12細胞后細胞活力的變化［12］（圖4）。此法測定迅速,并且能夠進行定量分析。但是乳酸脫氫酶是大分子,只有靶細胞膜完全被破壞后才能釋放出來，不能較早的反映細胞的存活狀況。影響因素較多，例如，培養(yǎng)基、測定環(huán)境的溫度、pH、反應(yīng)時間等［13］。

(農(nóng)一卻二(農(nóng)一卻二s?>EMVtBa;工0JEndoVSOPVSOP(25DM9F撫ml)[250陽Fe/ml)HOOpgFe/ml)圖.4不同納米顆粒對PC12細胞處理后的細胞活力變化針對細胞凋亡的檢測（形態(tài)學(xué)觀察）納米顆粒的細胞毒性可促進細胞的凋亡，細胞凋亡后細胞膜仍完整，通過普通光學(xué)顯微鏡下可觀察到貼壁生長的凋亡細胞皺縮、圓化，細胞的體積變小?？梢姲ぐl(fā)泡的現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。在熒光顯微鏡下，吖啶橙染色后，活細胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光,胞質(zhì)呈橘紅色熒光，而凋亡細胞核染色質(zhì)的黃綠色熒光濃聚在核膜內(nèi)側(cè)（圖5）。透射電鏡下可觀察到細胞凋亡時特征性的超微結(jié)構(gòu)改變，如凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮，表面微絨毛消，核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，呈新月形［14。］圖.5凋亡細胞的熒光顯微圖像針對細胞壞死的檢測（細胞膜不完整）4.1中性紅染色中性紅的攝入能力可以用來檢測細胞增殖或細胞毒性。中性紅不帶電荷，可以被活細胞所攝入，并在溶酶體中積累。在細胞增殖加快時，細胞數(shù)量增多，可以攝入的中性紅的量就會增加。在細胞受到損傷時，中性紅的攝入能力會下降。這樣通過對于中性紅攝入量的不同就可以確定細胞的增殖或毒性情況，它在540nm出有較高的吸收值。中性紅同時也是一種pH指示劑，在酸性時呈紅色，在pH6.8升至pH8.0時由紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。細胞核中的核酸呈酸性，因此細胞核會被染成紅色。由于溶酶體(lysome)中也是酸性環(huán)境，因此溶酶體也可以被中性紅染色液染成紅色。臺盼藍染色臺盼藍是帶電荷的分子，不能進入正常的胞膜結(jié)構(gòu)完整的活細胞；而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，臺盼藍就會進入細胞，將細胞染成藍色，并且在605nm波長處有較強的吸收。通過顯微鏡下直接計數(shù)或顯微鏡下拍照后計數(shù)，就可以對細胞存活率進行比較精確的定量。通常認為細胞膜完整性喪失，即可認為細胞已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因此，借助臺盼藍染色可以非常簡便、快速地區(qū)分活細胞和死細胞。用此方法檢測細胞毒性，可重復(fù)性好。乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠該法包含兩種化學(xué)物質(zhì)，乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠。乙酰氧甲基鈣黃綠素，是電中性的酯分子，可以通過擴散進入細胞，一旦進入細胞就會被酯酶轉(zhuǎn)化為帶綠色熒光的鈣黃綠素分子。相反，若細胞損壞或死亡，本身不能滲透進入細胞的溴化乙錠與核酸結(jié)合，可激發(fā)發(fā)紅色熒光，在495nm出激發(fā)，乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠分別在515nm、635nm熒光信號最明顯。針對DNA損傷的檢測(彗星電泳法)彗星電泳技術(shù),即單細胞凝膠電泳(Singlecellgelelectrophoresis,SCGE),可用于觀察單個細胞DNA的損傷。比技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于放射生物學(xué)、DNA斷裂與修復(fù)、毒理學(xué)、腫瘤治療評價、細胞凋亡等領(lǐng)域的研究。將單個細胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解、堿化處理后，再在電場中進行短時間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細胞中形成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案，而正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形，彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。此時彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式相連。DNA損傷越嚴重，導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散，產(chǎn)生的斷裂點越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部出現(xiàn)的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和熒光強度越大(圖6)。通過測量彗星尾部的長度、面積或熒光強度等指標，可以對DNA的損傷程度進行定量分析，這是一種快速簡便的毒性檢測法［15。］?HMdDMA97.54%?HmJDNA83.25%HeadDMA6S.59%HeadOMa23,36^*圖6.熒光顯微圖像結(jié)論大量研究表明，多種納米顆粒顯示其細胞生物毒性效應(yīng)，因而納米材料的細胞生物毒性效應(yīng)研究工作廣泛開展，但是其細胞毒性評價方法仍有缺陷，對于納米材料的安全性評估還很不完善。納米顆粒的毒性效應(yīng)與納米顆粒的粒徑、比表面積、晶體構(gòu)象、暴露計量以及暴露方式有關(guān)，因此在完善納米材料毒性評估方法的同時，研究重點還要放在如何通過化學(xué)修飾保持納米材料的優(yōu)越性又避免其毒性效應(yīng)，使其更為安全、廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域。參考文獻1.Han,J.Y.,Z.T.Yu,L.Zhou.TheEffectsofDifferentHydroxyapatite/TiO2CompositeCoatingsonProteinExpressionofOsteoblast.inMaterialsScienceForum.2009.TransTechPubl.Lee,Y.J.,D.S.Ruby,D.W.Peters,B.B.McKenzie,J.W.P.Hsu,ZnOnanostructuresasefficientantireflectionlayersinsolarcells.Nanoletters,2008.8(5):p.1501-1505.Oberd6rster,G.,A.Maynard,K.Donaldson,V.Castranova,J.Fitzpatrick,K.Ausman,J.Carter,B.Karn,W.Kreyling,D.Lai,Principlesforcharacterizingthepotentialhumanhealtheffectsfromexposuretonanomaterials:elementsofascreeningstrategy.ParticleandFibreToxicology,2005.2(1):p.8.Marquis,B.J.,S.A.Love,K.L.Braun,C.L.Haynes,Analyticalmethodstoassessnanoparticletoxicity.Analyst,2009.134(3):p.425-439.Lewinski,N.,V.Colvin,R.Drezek,Cytotoxicityofnanoparticles.Small,2007.4(1):p.26-49.Singh,N.,G.J.Jenkins,R.Asadi,S.H.Doak,Potentialtoxicityofsuperparamagneticironoxidenanoparticles(SPION).NanoRev,2010.1.Mosmann,T.,Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.JImmunolmethods,1983.65(1-2):p.55-63.Mahmo