蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量測定方法的比較

蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量測定方法的比較

低濃度苯酚注射液法（以下簡稱低濃度法）和考證藍染色粉與法（以下簡稱bradford法）是兩種常見的蛋白質(zhì)測定方法。在用于測定蚯蚓提取物的蛋白質(zhì)含量時,發(fā)現(xiàn)2種方法的測定結(jié)果差異很大。為選擇準(zhǔn)確測定蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量的方法,本文結(jié)合實驗和有關(guān)文獻對此進行了分析。1試劑與儀器正蚓科(Lumbricidae)雙胸蚓屬(Bimastos)赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida),中國科學(xué)院生物物理研究所百奧溶栓膠囊公司提供?？捡R斯亮藍G-250,分析純,上?；瘜W(xué)試劑站進口分裝;Folin酚試劑SigmaF-9252,北京經(jīng)科化學(xué)試劑經(jīng)營公司;牛血清白蛋白(BSA),華美生物工程公司;堿性蛋白酶(30000U/g),丹麥NovoNordisk公司。UV-1601紫外可見光分光光度計,日本島津公司。2方法2.1共同語言樣品的制備將赤子愛勝蚓經(jīng)過稱重、破碎、抽提、離心等工藝進行提取,獲得蚯蚓提取物供試品,批號:04072205。2.2改進的低效率法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制稱取BSA25mg,置100mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,制得250μg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液。依法測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.2逃走提取中的蛋白質(zhì)含量測定取蚯蚓提取物溶液1mL,依法測定。2.3brad霍法2.3.1磷酸溶液配制考馬斯亮藍儲備液:稱取考馬斯亮藍G-250100mg溶于95%乙醇50mL中,加85%磷酸100mL,加水稀釋至200mL,4℃放置。考馬斯亮藍工作液:1份上述儲備液,加4份水,混勻,過濾,臨用前配制。2.3.2對照品溶液的制備稱取BSA50mg,置50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,得到1mg/mL的BSA對照品溶液。分別取BSA對照品溶液0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8mL,向其中分別加入水1.0,0.9,0.8,0.6,0.4,0.2mL,混勻。向6種不同濃度的BSA水溶液中各加入考馬斯亮藍工作液5mL,混勻。室溫靜置5min。595nm比色,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3.3逃走提取中的蛋白質(zhì)含量測定量取蚯蚓提取物溶液0.1mL,加入考馬斯亮藍工作液5mL,混勻,室溫放置5min,比色。2.4酶解bsa稱取BSA250mg,加水溶解至250mL。取100mL,用NaOH調(diào)定pH值至8.5,加入堿性蛋白酶溶液(1mg/mL)1mL,50℃酶解5h。分別取酶解前、后的BSA水溶液5mL于100mL容量瓶中,加水至刻度。用改良Lowry法與Bradford法分別測定酶解前、后BSA水溶液中蛋白質(zhì)含量,進行統(tǒng)計學(xué)分析。3結(jié)果3.1bradford法見圖1,2。改良Lowry法的回歸方程:A=1.36C+0.011;Bradford法的回歸方程:A=0.8937C+0.0259。其中A為吸收度,C為蛋白質(zhì)量。3.2通過對樣品中氮含量的測定結(jié)果見表1,改良Lowry法的測定結(jié)果明顯高于Bradford法。3.3不同方法測定蛋白質(zhì)含量的情況,改良低ras值的測定總參數(shù)見表2。酶解前,2法測定BSA水溶液蛋白質(zhì)含量的測定值相近,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(P>0.05)。使用改良Lowry法測定時,酶解前、后蛋白質(zhì)測定值相近,僅酶解后的略有增高,統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(P>0.05);而Bradford法酶解后的蛋白質(zhì)測定值較酶解前呈現(xiàn)大幅下降,統(tǒng)計學(xué)分析兩者存在顯著性差異(P<0.05)。4改良低質(zhì)低效Bradford法是由于考馬斯亮藍染料G-250在一定濃度乙醇和酸性條件下呈現(xiàn)紅色,與蛋白質(zhì)結(jié)合后產(chǎn)生藍色化合物,化合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈現(xiàn)正比關(guān)系。改良Lowry法是在福林-酚顯色的基礎(chǔ)上加入了雙縮脲法顯色的優(yōu)點。改良Lowry法是首先利用堿性硫酸銅試液中的Cu2+與肽鍵絡(luò)合,生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物;然后此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原,生成磷鉬藍和磷鎢藍的深藍色混合物,顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正相關(guān)。2種顯色機制的協(xié)同作用,使改良Lowry法的顯色強度提高5~15倍,靈敏度為雙縮脲法的100倍。由兩者作用機制得知,改良Lowry法對蛋白質(zhì)和小分子的多肽,具有同樣的顯色效果。通過使用改良Lowry法測定BSA水溶液酶解前后蛋白質(zhì)含量證實了此結(jié)論,統(tǒng)計學(xué)分析(P>0.05)表明此法測定酶解前后的蛋白含量時無明顯差異,即此法對蛋白質(zhì)和多肽具有同樣的顯色強度。而使用Bradford法進行蛋白質(zhì)含量測定時,BSA酶解后的蛋白質(zhì)測定值較酶解前出現(xiàn)了大幅下降,僅是酶解前的1/10左右,統(tǒng)計學(xué)分析(P<0.05)表明用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量時酶解前后的蛋白質(zhì)測定值存在顯著性差異,說明Bradford法對多肽的顯色強度差。2法測定酶解前的BSA水溶液蛋白含量時,Bradford法的測定值略高于改良Lowry法,統(tǒng)計學(xué)分析(P>0.05)表明2法無明顯差別(實驗中加入酶解的酶量僅占待測BSA的1%,且2法所加酶量相等,所以酶本身與結(jié)果對比,基本無影響。)由此得知,在多肽含量多的供試品進行蛋白質(zhì)含量測定時,改良Lowry法更為準(zhǔn)確。由于蚯蚓提取物在提取過程中受到諸多因素作用,其中的蛋白質(zhì)成分不可避免地要發(fā)生水解反應(yīng),因而蚯蚓提取物中含有較多的多肽成分。所以,對其進行蛋白質(zhì)含量測定時,會出現(xiàn)改良Lowry法的測定值明顯高于Bradford法的結(jié)果。綜