五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

腐腐是中國(guó)傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵產(chǎn)品，在世界營(yíng)養(yǎng)林藝術(shù)部占有特殊地位。其口味鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富,是深受大眾喜愛(ài)的佐餐食品,被稱(chēng)為“東方奶酪”。釀造腐乳包括一系列的物理化學(xué)和生物化學(xué)過(guò)程,大豆浸泡、磨漿、點(diǎn)漿、壓榨成型制成豆腐的工序?qū)儆谖锢砘瘜W(xué)過(guò)程,豆腐前發(fā)酵培菌和加輔料后發(fā)酵等主要屬于生物化學(xué)過(guò)程,每一道工序都會(huì)影響其品質(zhì)。在腐乳生產(chǎn)過(guò)程中有多種微生物和酶參與,其共同作用造就了腐乳的獨(dú)特風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和一些特殊的保健功能。腐乳發(fā)酵階段是微生物發(fā)揮作用的主要階段,發(fā)酵階段可分為前期培菌和后期發(fā)酵。前期培菌是在半開(kāi)放條件下培養(yǎng)微生物的酶系;后期發(fā)酵主要是酶系與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過(guò)程。因此,腐乳的生產(chǎn)離不開(kāi)微生物。常用于生產(chǎn)腐乳的微生物有毛霉、根霉、米曲霉、酵母菌、紅曲霉及細(xì)菌等,其中,毛霉產(chǎn)蛋白酶種類(lèi)較多、產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。本研究以腐乳生產(chǎn)常用的雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實(shí)驗(yàn)菌株,通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,提高毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力,從而縮短腐乳發(fā)酵周期、解決腐乳生產(chǎn)受季節(jié)限制的問(wèn)題,提高腐乳的生產(chǎn)效率、滿足市場(chǎng)需求。1材料和方法1.1試劑、儀器和儀器雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)菌種編號(hào)3118、五通橋毛酶(WutungkiaoMucor)菌種編號(hào)40477購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;氯化鈣、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、碳酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蔗糖分析純,西隴化工股份有限公司;三氯乙酸分析純,天津市巴斯夫化工有限公司;黃豆粉、豆坯哈爾濱珍味糧油冷凍產(chǎn)品商貿(mào)集團(tuán)公司;可溶性淀粉、葡萄糖分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂分析純,天津博迪化工股份有限公司;乳糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酪蛋白、福林酚分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限公司。80-2B型臺(tái)式低速離心機(jī)湖南星科科學(xué)儀器有限公司;722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;無(wú)菌操作臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;SY-2-4型電熱式恒溫水浴鍋天津歐諾儀器儀表有限公司;電子天平北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。1.2最佳碳源及濃度的確定1.2.1酶液制備取出于28℃、pH6.0條件下,發(fā)酵60h的毛霉發(fā)酵液于80目的網(wǎng)篩過(guò)濾去菌絲,之后將濾液在4000r/min下離心20min;取1.0mL濾液于100.0mL容量瓶中,用磷酸緩沖溶液定容至100.0mL,即制得稀釋酶液。1.2.2中性蛋白酶酶活測(cè)定方法按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527-2009),采用Folin-酚法測(cè)定中性蛋白酶活力。1.2.3毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化1.2.3.1碳源種類(lèi)及濃度對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別添加10%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉五種碳源,以10%大米粉作參照,并加入2%的豆坯、0.5%的NaCl配制培養(yǎng)基。每500mL三角瓶裝液量150mL,調(diào)節(jié)pH6.0,0.1MPa、121℃滅菌30min。冷卻后接入孢子數(shù)為×106、2%的毛霉孢子懸液,于28℃下培養(yǎng)60h,充分發(fā)酵后制成粗酶液,測(cè)定中性蛋白酶酶活力,確定最佳碳源種類(lèi)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別添加8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的蔗糖作為碳源,在相同條件下,測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定碳源最適添加比例。1.2.3.2氮源種類(lèi)及濃度對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別添加濃度為2%酵母膏、黃豆粉、豆坯、硫酸銨四種氮源,以2%蛋白胨為參照,并加入10%的蔗糖(五通橋毛霉為8%)、0.5%的NaCl配制培養(yǎng)基,其他條件與1.2.3.1相同,測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶最佳氮源種類(lèi)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別添加1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%比例的黃豆粉作為氮源,在相同條件下,充分發(fā)酵后制成粗酶液,測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定氮源最適添加比例。1.2.3.3無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及濃度對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響由于無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及添加量對(duì)毛霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶影響很大,故本實(shí)驗(yàn)以相關(guān)的研究資料及參考文獻(xiàn)[12-14]為依據(jù),分別在毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基中添加四種無(wú)機(jī)鹽成分,MgSO40.04%、NaCl0.5%、KH2PO40.4%、CaCl20.1%,以空白作參照,并加入10%的蔗糖(五通橋毛霉為8%)、3%的黃豆粉,其他條件與1.2.3.1相同,充分發(fā)酵后制成粗酶液,測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定最佳無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及濃度。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,KH2PO4的添加量分別為0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%;CaCl2的添加量分別為0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%。同時(shí)添加其他輔料配制培養(yǎng)基,同樣根據(jù)蛋白酶活力確定兩種無(wú)機(jī)鹽的最適添加濃度。1.2.3.4毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn),以蔗糖添加量、黃豆粉添加量、KH2PO4、CaCl2為四個(gè)影響因素,采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)安排實(shí)驗(yàn),以毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活為指標(biāo),進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn),因素水平表見(jiàn)下表1和表2。1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析本實(shí)驗(yàn)采用單因素及無(wú)空列正交實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)做三次平行實(shí)驗(yàn),研究了幾個(gè)影響因素對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響,并使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,最后通過(guò)極差分析得出各個(gè)影響因素的顯著性。2結(jié)果與分析2.1蔗糖對(duì)毛霉產(chǎn)蛋白酶酶活的影響由圖1可知,本實(shí)驗(yàn)所使用的幾種碳源,均可被兩種毛霉利用產(chǎn)生蛋白酶。蔗糖和葡萄糖對(duì)于蛋白酶的合成有較好的促進(jìn)作用,其中蔗糖對(duì)于蛋白酶合成的誘導(dǎo)作用要顯著優(yōu)于其他碳源(p<0.05),兩種毛霉菌產(chǎn)蛋白酶酶活分別達(dá)1227.68、1196.19U/mL。葡萄糖有利于毛霉菌絲體的生長(zhǎng),但對(duì)于蛋白酶合成的誘導(dǎo)作用無(wú)蔗糖明顯(p<0.05)。故將蔗糖選為毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。由圖2可知,隨著蔗糖的加入,兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高;在蔗糖濃度在8%~9%之間時(shí),蛋白酶酶活上升較顯著(p<0.05);當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到10%時(shí),蛋白酶酶活也達(dá)到最大值1242.05U/mL和1208.74U/mL;但此后,隨著蔗糖濃度繼續(xù)升高時(shí),蛋白酶酶活開(kāi)始下降,可能是由于過(guò)多的蔗糖利于菌絲體的大量生長(zhǎng)繁殖而抑制了蛋白酶的生成。故毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度選為10%。2.2最佳氮源的確定由圖3可知,本實(shí)驗(yàn)所提供的幾種氮源,均可被兩種毛霉利用產(chǎn)生蛋白酶。其中黃豆粉的促進(jìn)作用較明顯(p<0.05),雅致放射毛霉和五通橋毛霉蛋白酶酶活分別達(dá)1245.42、1230.28U/mL,而其他幾種氮源雖可被毛霉利用,但對(duì)于蛋白酶合成的誘導(dǎo)作用沒(méi)有有利的影響(除酵母膏外),蛋白酶酶活沒(méi)有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的酶活高。故將黃豆粉選為毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。由圖4可知,隨著黃豆粉的加入,兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高;在黃豆粉添加量在1%~2%之間時(shí),蛋白酶酶活上升較顯著(p<0.05);隨后,蛋白酶酶活上升較緩慢,但仍呈上升趨勢(shì);當(dāng)黃豆粉添加量在3%時(shí),蛋白酶酶活達(dá)到最大值1260.38、1245.37U/mL,故毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源添加量選為3%。2.3基于mgso4和cacl2的誘導(dǎo)毛霉產(chǎn)氧化酶由圖5可知,MgSO4、KH2PO4和CaCl2相對(duì)于NaCl而言,在提高蛋白酶酶活的影響較顯著(p<0.05)。添加MgSO4、KH2PO4和CaCl2的培養(yǎng)基中,雅致放射毛霉的蛋白酶酶活力分別達(dá)到了1270.46、1287.36、1280.32U/mL;五通橋毛霉蛋白酶酶活力分別達(dá)到了1260.16、1270.15、1272.76U/mL;磷酸鹽在發(fā)酵液中起到了緩沖體系pH的作用,對(duì)保持產(chǎn)酶環(huán)境的穩(wěn)定,同時(shí)也同MgSO4和CaCl2一起起到了誘導(dǎo)毛霉產(chǎn)蛋白酶的作用。綜上所述,在優(yōu)化毛霉蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方案中的無(wú)機(jī)鹽選擇為MgSO4、KH2PO4和CaCl2。因?yàn)镸gSO4的添加量0.04%很小,故對(duì)另兩種無(wú)機(jī)鹽設(shè)置濃度梯度實(shí)驗(yàn)。由圖6可知,隨著KH2PO4的加入,兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高。雅致放射毛霉在KH2PO4添加量在0.3%~0.35%之間時(shí),蛋白酶酶活上升較顯著(p<0.05);當(dāng)KH2PO4添加量超過(guò)0.40%時(shí),蛋白酶酶活出現(xiàn)下降趨勢(shì),即當(dāng)KH2PO4濃度為0.40%時(shí),蛋白酶酶活達(dá)到最大值1283.53U/mL;對(duì)于五通橋毛霉,當(dāng)KH2PO4濃度為0.35%時(shí),五通橋蛋白酶酶活達(dá)到最大值1282.58U/mL,故KH2PO4的最佳濃度分別選為0.40%和0.35%。由圖7可知,隨著CaCl2的加入,兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高。對(duì)于雅致放射毛霉,CaCl2添加量在0.06%~0.1%之間時(shí),蛋白酶酶活上升;當(dāng)CaCl2添加量超過(guò)0.1%時(shí),蛋白酶酶活下降;當(dāng)CaCl2濃度為0.1%時(shí),雅致放射毛霉蛋白酶酶活達(dá)到最大值1288.05U/mL。而CaCl2濃度為0.08%時(shí),五通橋毛霉蛋白酶酶活達(dá)到最大值1286.02U/mL。綜上,兩種毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳CaCl2濃度分別選為0.1%和0.08%。2.4打造不同添加量的小細(xì)胞培養(yǎng)基2.4.1雅致放射毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化的結(jié)果與分析在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以A:蔗糖、B:黃豆粉、C:KH2PO4、D:CaCl2的添加量為四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。選用L9(34)正交表對(duì)雅致放射毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選,采用SPSS17.0進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3中實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差RB>RC>RD>RA可知,四個(gè)因素對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響趨勢(shì)為B>C>D>A,即黃豆粉添加量對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響最顯著,其次為KH2PO4、CaCl2、蔗糖添加量。最佳參數(shù)組合為A2B1C2D3,即當(dāng)蔗糖添加量為10%,黃豆粉添加量為2.5%,KH2PO4添加量為0.4%,CaCl2添加量為0.11%時(shí),雅致放射毛霉產(chǎn)蛋白酶酶活最高達(dá)1310.56U/mL。2.4.2五通橋毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以A:蔗糖、B:黃豆粉、C:KH2PO4、D:CaCl2的用量為三個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以蛋白酶酶活作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。選用L9(34)正交表對(duì)五通橋毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選,采用SPSS17.0進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表4。由表4中實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差RB>RD>RC>RA可知,四個(gè)因素對(duì)五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響趨勢(shì)為B>D>C>A,即黃豆粉添加量對(duì)五通橋毛霉產(chǎn)蛋白酶的影響最顯著,其次為CaCl2、KH2PO4、蔗糖添加量。最佳參數(shù)組合為A2B2C3D1,即當(dāng)蔗糖添加量為10%,黃豆粉添加量為3.0%,KH2PO4添加量為0.37%,CaCl2添加量為0.07%時(shí),五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)1306.38U/mL。3中性蛋白酶酶活力本研究以雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究了不同發(fā)酵培養(yǎng)基成分及添加量對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響,得出雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為:蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為2.5%、KH2PO4添加量為