蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)病機制

蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)病機制

以色列科學(xué)家a.ciechanor、a.hazoggrimek和美國科學(xué)家o.russell揭示了蛋白質(zhì)分解的機制性，并確定了蛋白質(zhì)分解的研究方向。這一這項研究有助于人類進一步了解自身的循環(huán)系統(tǒng)，對修復(fù)和控制dna和治療人類疾病具有重要意義。蛋白質(zhì)的泛素化,其實是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種.蛋白質(zhì)翻譯后修飾,是指在mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)后,對蛋白質(zhì)上個別氨基酸殘基進行共價修飾的過程.蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用.人類基因組計劃的完成是20世紀(jì)最偉大的科技成果之一.在對人類基因組進行仔細研究后發(fā)現(xiàn),人類基因大約有30000～50000個,這僅僅是線蟲和果蠅染色體基因數(shù)的3～5倍.而生命體內(nèi)復(fù)雜生命過程的調(diào)控,僅僅靠這樣小數(shù)目的基因遠不能滿足需要.因此,蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程尤為重要.它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,功能更為完善,調(diào)節(jié)更為精細,作用更為專一.細胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)的功能,是通過動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾來調(diào)控的;細胞的許多生理功能,例如細胞對外界環(huán)境的應(yīng)答,也是通過動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾來實現(xiàn)的.人類生命過程的復(fù)雜性不單是基因直接表達的結(jié)果,正是蛋白質(zhì)翻譯后修飾,使得一個基因并不只對應(yīng)一個蛋白質(zhì),從而賦予人類生命過程更多的復(fù)雜性.1蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)在真核動物細胞中有20多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程,常見的有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙?；?近年來,隨著人類基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)工作的開展,關(guān)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究也取得一系列進展.1.1biquemine-terenalhydralhydrrash和泛素特異性蛋白酶一直以來,人們都忽視了蛋白質(zhì)水解酶參與的細胞功能的調(diào)控.泛素和與其相關(guān)的蛋白水解酶的發(fā)現(xiàn),給整個科學(xué)界帶來了革命性的影響.泛素由76個氨基酸組成,高度保守,普遍存在于真核細胞內(nèi),故名泛素.共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶識別并降解,這是細胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑.與消化道內(nèi)進行的蛋白質(zhì)水解不同,從泛素與蛋白的結(jié)合到將蛋白水解成小的肽段,整個水解過程需要能量參與.人們開始意識到泛素-蛋白酶系統(tǒng)是一個對于真核細胞非常重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng).(1)泛素-蛋白酶系統(tǒng).泛素-蛋白酶系統(tǒng)是存在于所有真核生物細胞的調(diào)控系統(tǒng).20世紀(jì)70～80年代,泛素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解的機理之謎被揭開(圖1),降解過程中需要三種酶的參與:泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素蛋白質(zhì)連接酶(E3)[5～7].泛素化降解蛋白的過程中對蛋白的特異性識別依賴E3.由E2s和E3s介導(dǎo)的泛素化過程可以被去泛素化酶(DUBs)逆轉(zhuǎn)(圖2).目前發(fā)現(xiàn)的DUBs可分為兩大類:泛素碳端水解酶(ubiquitinC-terminalhydrolases,UCHs)和泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-spicificprocessingproteases,UBPs),兩者都是半胱氨酸水解酶.通常情況下,UCHs主要水解羰基端的酯和泛素的氨基鍵,也可以分解泛素前體,生成活潑的泛素分子;UBPs分解泛素多聚體鏈.(2)泛素化在生命體中的作用.泛素化對于細胞分化、細胞器的生物合成、細胞凋亡、DNA修復(fù)、新蛋白生成、調(diào)控細胞增殖、蛋白質(zhì)輸運、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程都起到很重要的作用.Bence等發(fā)現(xiàn),蛋白的沉積可直接削弱泛素-蛋白酶系統(tǒng)的功能.兩種不相關(guān)但有聚合傾向的蛋白的瞬時表達,幾乎可以完全抑制泛素-蛋白酶系統(tǒng).由于泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解在調(diào)節(jié)細胞活動中的重要地位,引起蛋白聚集的潛在機制將導(dǎo)致細胞的紊亂和細胞凋亡.神經(jīng)元包含體中含有泛素化的纖維狀蛋白沉積物,是很多人類神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、帕金森病的主要特征.Engelender等發(fā)現(xiàn)Lewy體中存在泛素連接酶E3SIAH-1,SIAH-2與synphilin-1的相互作用.Synphilin-1/SIAH復(fù)合物無法水解,導(dǎo)致生成了大量泛素化的細胞內(nèi)含物.與synphilin-1的情況類似,在完整的細胞內(nèi),SIAH-2與α-synuclien作用使之單泛素化,單泛素化蛋白是無法被蛋白水解酶特異性地水解.如果泛素-蛋白酶系統(tǒng)無法水解蛋白,會導(dǎo)致細胞內(nèi)含物的形成.Layfield等通過在分子水平檢查含泛素的包含體,對包含體中出現(xiàn)泛素化蛋白給予了新的解釋:包含體中泛素化蛋白的出現(xiàn),不能說明是由泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解的失調(diào)所引起的,而可能是細胞二級的、保護性的反應(yīng).泛素化很可能是一個后續(xù)過程.在這樣一個假設(shè)模型下,其他因素更易促進包含體的形成.泛素化也是組蛋白修飾的一種重要形式,組蛋白的H2A和H2B是泛素化多發(fā)位點,已經(jīng)找到了組蛋白H2B泛素化酶[13～15],并且發(fā)現(xiàn)組蛋白H2B泛素化和組蛋白甲基化存在關(guān)聯(lián).Wang等對一種E3hPRC1L(humanpolycombrepressivecomplex1-like)進行純化,并對其功能進行確認,發(fā)現(xiàn)hPRC1L特異性地作用于組蛋白H2A,對核小體組蛋白H2A的Lys119單泛素化.另外,S.cerevisiaeH2BC端的Lys123是E3Rad6的作用底物,這種修飾對減數(shù)分裂和有絲分裂都很重要.TBP相關(guān)復(fù)合物TafII250被證明能泛素化修飾H1,這也可能和轉(zhuǎn)錄有關(guān).激活子的泛素化對于轉(zhuǎn)錄激活是十分重要的.2001年Salghetti等提出,泛素化可以作為激活作用和激活子重新構(gòu)造的雙信號,調(diào)節(jié)TAD功能.E3Met30使轉(zhuǎn)錄激活子VP16TAD泛素化.在對p53的研究中發(fā)現(xiàn),HAUSP(herpesvirusassociatedubiquitinspecificprotease)是一種在體內(nèi)外能對p53去泛素化的蛋白,在Mdm2存在下仍可穩(wěn)定p53.在體內(nèi)外,COP1可作為泛素蛋白連接酶特異性地與p53結(jié)合,然后依靠泛素-蛋白酶系統(tǒng)將其水解,阻止p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和細胞凋亡.1.2過度磷酸化促進細胞凋亡和dna修復(fù)磷酸化是通過蛋白質(zhì)磷酸化激酶將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白的特定位點上的過程.大部分細胞過程實際上是被可逆的蛋白磷酸化所調(diào)控的,至少有30%的蛋白被磷酸化修飾.磷酸化的作用位點為蛋白上的Ser,Thr,Tyr殘基.在磷酸化調(diào)節(jié)過程中,細胞的形態(tài)和功能都發(fā)生改變.可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程(圖3),如細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細胞的增殖、發(fā)育和分化等.Fisher和Krebs因其在蛋白質(zhì)可逆磷酸化作為一種生物調(diào)節(jié)機制方面的研究而獲得1992年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎.在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,作為細胞信號的一些激素或細胞因子,與細胞膜受體或細胞內(nèi)受體結(jié)合并被激酶激活,激素或信號因子隨著激酶的磷酸化也被磷酸化,引起細胞內(nèi)的信號效應(yīng).在癌癥研究中發(fā)現(xiàn),微管蛋白的磷酸化可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生.細胞中使用“最后檢驗點策略”(LCP)控制細胞凋亡,即將含有硝基化酪氨酸的α-微管蛋白組裝到微管上,這將導(dǎo)致微管功能失常而最終導(dǎo)致細胞凋亡.但如果微管蛋白酪氨酸連接酶(TTL)被磷酸化,將可能使細胞“躲過”LCP控制的細胞凋亡,從而最終發(fā)展成為癌細胞.在DNA新陳代謝的研究中發(fā)現(xiàn),細胞中DNA損傷可導(dǎo)致人的復(fù)制蛋白A(RPA)32kD亞基N端的過度磷酸化,這有助于調(diào)控DNA的新陳代謝,促進DNA修復(fù).有數(shù)據(jù)顯示,過度磷酸化會導(dǎo)致RPA構(gòu)象改變,降低DNA復(fù)制的活性,但不會影響DNA的修復(fù).Cabrejos等研究了脊椎動物蛋白激酶CK2催化通用轉(zhuǎn)錄因子TFⅡA,TFⅡE,TFⅡF和RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)的磷酸化作用.結(jié)果顯示,TFⅡA,TFⅡE和TFⅡF最大的亞單元被CK2全酶磷酸化,RNA聚合酶Ⅱ的214kD和20.5kD亞基被CK2磷酸化;TFⅡA,TFⅡF和RNAPⅡ的磷酸化促進了Ad-MLP啟動子在TATAbox上形成復(fù)合物,其中TFⅡF的磷酸化促進轉(zhuǎn)錄,RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化則對轉(zhuǎn)錄有明顯的抑制作用.Maile等在對組蛋白磷酸化的研究中發(fā)現(xiàn),果蠅通用轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD亞單位TAF1的C端激酶結(jié)構(gòu)域(carboxyl-terminalkinasedomain,CTK)對組蛋白H2B上進化保守的絲氨酸33(H2B-S33)進行磷酸化.細胞周期調(diào)節(jié)基因string和分割基因giant的啟動子H2B-S33的磷酸化與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān).Evans等在對肝炎病毒C(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白5A(NS5A)的研究中發(fā)現(xiàn),RNA的有效復(fù)制需要HCVNS5A和hVAP-A(humanvesicle-associatedmembraneprotein-associatedproteinA)的相互作用.進一步的研究發(fā)現(xiàn),抑制NS5A磷酸化的適應(yīng)性突變,可促進其與hVAP-A的結(jié)合.NS5A的磷酸化負向調(diào)節(jié)濾過性病毒RNA的復(fù)制.Jones等發(fā)現(xiàn)了一個新的調(diào)控SHP-1的機制通過蛋白激酶Cα催化SHP-1C端Ser591磷酸化,磷酸化負向調(diào)節(jié)SHP-1的活性,即SHP-1的磷酸化導(dǎo)致它在體外對Vav1酪氨酸去磷酸化能力的降低,進而導(dǎo)致底物酪氨酸磷酸化程度加深.李艷梅等1,2)研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的磷酸化通過氫鍵作用從而改變蛋白的局部構(gòu)象.在對c-Fos蛋白C端結(jié)構(gòu)域上的磷酸化修飾的研究中,發(fā)現(xiàn)S362的磷酸化引發(fā)了局部構(gòu)象的改變進而影響turn結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性3).另外采用MALDI-TOFMS對源自磷酸化蛋白的磷肽進行了源后裂解(PSD)的分析.探索出了不同氨基酸磷酸化的磷肽在MALDI-TOFMS中源后裂解的規(guī)律,提供了磷肽中磷酸化位點的信息.1.3糖基化位點與蛋白激酶作用位點的比較蛋白質(zhì)的糖基化是低聚糖以糖苷的形式與蛋白上特定的氨基酸殘基共價結(jié)合的過程.蛋白質(zhì)糖基化可以按照氨基酸和糖的連接方式分為四類:O位糖基化、N位糖基化、C位甘露糖化以及GPI(glycophosphatidlyinositol)錨定連接.O位糖基化多發(fā)生在臨近脯氨酸的絲氨酸或蘇氨酸殘基上,糖基化位點處的蛋白多為β構(gòu)型.O位多聚糖以逐步加接單糖的形式形成低聚糖.目前沒有發(fā)現(xiàn)特異的蛋白序列作為糖基化位點.O位糖基化反應(yīng)發(fā)生在細胞內(nèi)兩個部位,一是發(fā)生在高爾基體上,一是發(fā)生在細胞核或細胞質(zhì)中.發(fā)生在高爾基體上的糖基化,起始于絲氨酸和蘇氨酸羥基上連接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、海藻糖等的還原端.分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白O位糖基化發(fā)生在N位糖基化及蛋白折疊之后,在高爾基體順面上完成.發(fā)生在細胞核和細胞質(zhì)中的糖基化是在絲氨酸或蘇氨酸殘基上連接一個單糖:N-乙酰葡萄糖胺.在哺乳動物體內(nèi)最常見的O位糖基化形式是由GalNAc轉(zhuǎn)移酶催化的O-GalNAc糖基化,進而連接Gal,GalNAc或者GlcNAc部分.O-GlcNAc糖基化從構(gòu)象上分為兩類:O-α-GlcNAc和O-β-GlcNAc,且此糖基化過程可逆.它主要有三個特征:糖基化位點與蛋白激酶作用位點相似;糖基化與磷酸化相互抑制,對很多蛋白有去磷酸化作用;O-GlcNAc糖基化高度動態(tài),對細胞信號等能做出快速反應(yīng).N位糖基化是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上由糖基轉(zhuǎn)移酶催化,在內(nèi)分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白的天冬酰氨殘基的氨基上結(jié)合寡糖的過程.普遍認為N位糖基化發(fā)生在蛋白Asn-Xaa-Ser/Thr(Xaa為除脯氨酸外的所有氨基酸殘基)序列上,少數(shù)情況下Asn-Xaa-Cys序列也作為糖基化位點.C位甘露糖化是將一分子α-mannopyranosyl殘基通過C—C鍵連接到色氨酸吲哚環(huán)C-2上,這種糖基化方式多發(fā)生在模體W-X-X-W,W-X-X-C或者W-X-X-F的第一個色氨酸殘基上.GPI錨定連接指的是磷脂酰-纖維糖組在靠近蛋白C端部位結(jié)合,將蛋白連接到細胞膜上.(1)糖基化位點分析.糖基化位點的確定需要對蛋白進行消化水解、分離,并采用質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)等檢測手段.液相色譜(LC)與MS相結(jié)合,也為在水解混合物中確定糖基化位點提供了可靠的方法.Krokhin等利用MALDI技術(shù)對糖基化位點進行指認和確定,并著手糖肽先導(dǎo)物離子自動指認軟件的開發(fā)工作.(2)糖蛋白的合成.糖蛋白的合成一直阻礙研究蛋白質(zhì)糖基化對蛋白功能和結(jié)構(gòu)的影響,當(dāng)涉及到對類似物進行選擇性修飾時化學(xué)合成尤為困難.2004年,Zhang等報道了一種共翻譯合成法,以得到選擇性糖基化修飾蛋白.被修飾的氨基酸可被基因編碼.該法可廣泛應(yīng)用于其他類型的后修飾的蛋白合成.同時也提供了一種制備糖肽藥物的潛在手段.近期研究發(fā)現(xiàn)人類胃腸道病原體(Campylobacterjejuni)內(nèi)N位糖基化途徑,在C.jejuni及相關(guān)種類細菌Campylobactercoli.內(nèi)O位糖基化途徑也被確認,這為糖肽生物合成的研究提供了模型.上述兩種細菌體內(nèi)的N和O位糖基化途徑與真核生物體內(nèi)的相似,具有相似的生物學(xué)功能,其基因類似物在其他有機體內(nèi)也能找到,連接到糖肽上的多聚糖復(fù)合物具有普遍的生物合成前體.(3)糖基化在生命體中的作用.蛋白質(zhì)的糖基化影響蛋白的功能,在許多生物過程中起著重要的作用,如免疫保護、病毒的復(fù)制、細胞生長、細胞與細胞之間的黏附、炎癥的產(chǎn)生等.很多蛋白,如轉(zhuǎn)錄因子、核小孔蛋白、熱休克蛋白、RNA聚合酶Ⅱ、致癌基因翻譯產(chǎn)物、酶等,都發(fā)現(xiàn)了糖基化這種翻譯后修飾方式(圖4).糖基化異常經(jīng)常導(dǎo)致疾病的發(fā)生.在帕金森病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他與自由基相關(guān)的疾病患者體內(nèi),檢測到鐵轉(zhuǎn)移蛋白糖基化水平過高.鐵轉(zhuǎn)移蛋白是一種糖基化的金屬轉(zhuǎn)運血清蛋白糖基化穩(wěn)定了鐵轉(zhuǎn)移蛋白,間接地調(diào)節(jié)了鐵離子的平衡.另有大量文獻報道糖基化的紊亂與迅速發(fā)展的肌營養(yǎng)不良相關(guān):Muntoni等通過對糖基轉(zhuǎn)移酶活性的鑒定,發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肌肉營養(yǎng)失調(diào)的新機制.在所有的病例中,普遍存在非正常的α-dystroglycan糖基化.李艷梅等1)研究了O-GlcNAc修飾的功能性多肽的合成,O-GlcNAc修飾對多肽構(gòu)象和生物功能的影響及O-GlcNAc和O-phosphorylation修飾對調(diào)節(jié)作用的聯(lián)系與影響.基于糖基化在生物體內(nèi)的重要作用,以糖基化作為治療位點的藥物也相繼問世,治療機制是對于相應(yīng)的酶進行調(diào)節(jié).含亞氨基的糖是單糖的模擬物它用N原子替代了環(huán)上的O原子.亞氨基糖家族可以抑制許多糖基化酶,包括ERα-葡糖苷酶Ⅰ,Ⅱ以及神經(jīng)酰胺特異性糖基轉(zhuǎn)移酶.對ERα-葡糖苷酶低水平的抑制,可以治療濾過性病毒感染而不危害宿主細胞.亞氨基糖N-nonyl-deoxynojirimycin(N-nonylDNI)對肝炎病毒B動物模型、小牛腹瀉病毒模型和肝炎病毒C體外模型,都具有抗病毒活性.1.4ras蛋白在細胞生物學(xué)和基蛋白質(zhì)脂基化為長脂肪鏈通過O或者S原子與蛋白質(zhì)綴合得到蛋白綴合物的過程,通常是蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸殘基的S鍵被棕櫚酰基乙?；?或者被法呢基烷基化.這兩種脂肪鏈通常共同修飾同一個蛋白質(zhì)分子,通過脂肪鏈與生物磷脂膜良好的相溶性,將蛋白質(zhì)固定在細胞膜上.脂蛋白是一類膜結(jié)合蛋白,其特定的脂肪鏈修飾,幫助這類蛋白在細胞膜上定位,并進一步協(xié)助該蛋白發(fā)揮生物功能.近年來生物物理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),脂蛋白只有固定在膜上之后,才有參與生物功能的活性.(1)脂蛋白的合成.近10年來,人們采用基因工程和有機合成相結(jié)合的方法合成脂蛋白綴合物,Waldmann等在此方面的研究取得了重大突破.他們應(yīng)用酶和貴金屬作為催化劑,利用固相合成法合成脂修飾的多肽.合成中引入一種人工的連接基團,并使用馬來酰亞胺己酸(MIC)作為保護基.通過該基團與Cys形成S鍵,將多肽片段與通過基因工程得到的截斷了C端的蛋白質(zhì)結(jié)合起來.體外實驗發(fā)現(xiàn),這些蛋白具有很好的生物功能.SPR測試發(fā)現(xiàn)脂蛋白和膜的結(jié)合力比較強,通過熒光顯微技術(shù)觀察這種脂蛋白在細胞中的分布情況,發(fā)現(xiàn)與生物體內(nèi)的現(xiàn)象非常接近.2003年,Waldmann等又提出了合成脂基中含有光學(xué)活性苯甲酮的法呢基修飾N-Ras七肽的方法.該合成策略是以固相合成帶有N端七肽的片斷聚合為基礎(chǔ).其中,合成的七肽綴合物帶有不同法呢基類似物修飾的半胱氨酸甲酯.運用該法還合成了與四種法呢基類似物相連的24肽,其中的兩種光學(xué)活性綴合物與人致瘤N-RasG12V?181相連.細胞轉(zhuǎn)化實驗顯示這種半合成蛋白仍保持生理活性.(2)脂基化在生命體中的作用.脂基化對于生物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程起著非常關(guān)鍵的作用,脂基化蛋白相當(dāng)于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān).在人體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,從生長因子到基因表達的調(diào)控需要經(jīng)過一系列的過程.信號從生長因子受體轉(zhuǎn)導(dǎo)到含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白,再繼續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)到鳥苷酸交換因子然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到Ras蛋白,Ras蛋白與GTPd的結(jié)合,對整個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程起到開關(guān)的作用.Ras在生物體內(nèi)的循環(huán)過程如圖5所示.近年來提出Ras蛋白是一種很有效的藥物靶點.非正常修飾的脂蛋白,會影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程在30%的人體腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Ras蛋白的變體,其中80%腫瘤為惡性.在細胞內(nèi),產(chǎn)生非正常修飾的原因是Ras蛋白發(fā)生了點突變,是化學(xué)信號刺激還是基因變異導(dǎo)致了Ras蛋白的突變,尚不清楚.以蛋白質(zhì)脂基化作為藥物靶點已取得一定成績.法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在抗腫瘤治療中具有很好的療效,而對于正常的細胞卻沒有任何毒性.同樣,棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑也表現(xiàn)出抗腫瘤特性,對于乳腺癌、前列腺癌等均有作用.1.5精氨酸殘基蛋白質(zhì)的甲基化同其他翻譯后修飾過程一樣,機理復(fù)雜,在生命調(diào)控過程中地位重要.蛋白質(zhì)的甲基化修飾是在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下,在賴氨酸或精氨酸側(cè)鏈氨基上進行的甲基化.另外也有對天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈羧基進行甲基化形成甲酯的形式,這里主要關(guān)注前一種甲基化形式.甲基化增加了立體阻力,并且取代了氨基的氫,影響了氫鍵的形成.因此,甲基化可以調(diào)控分子間和分子與目標(biāo)蛋白的相互作用.(1)精氨酸甲基化分類.1967年,Paik和Kim發(fā)現(xiàn)了精氨酸的甲基化,并發(fā)現(xiàn)了它在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄活化、蛋白質(zhì)分揀等生命過程中所起的作用.許多蛋白都可以進行精氨酸甲基化.真核細胞中,甲基化精氨酸有三種:NG-單甲基化精氨酸(MMA),NGNG(不對稱)二甲基化精氨酸(aDMA)和NGN’G(對稱)二甲基化精氨酸(sDMA).不同蛋白的精氨酸殘基采取不同的甲基化形式,有些蛋白也可采用多種甲基化形式.異核核糖核酸蛋白(hnRNPs)和其他RNA結(jié)合蛋白的甲基化經(jīng)常是在RGG三肽片段上.同時,所有RGG片段中的精氨酸甲基化,都是單甲基化和不對稱二甲基化而不是對稱二甲基化;在RXR片段和RG片段中也是不對稱二甲基化;而髓鞘堿蛋白(myelinbasicprotein,MBP)的精氨酸殘基不僅可以單甲基化,而且還可以進行對稱二甲基化;SmD1蛋白和SmD3蛋白中的精氨酸殘基進行對稱二甲基化.與hnRNPs不同,髓鞘堿蛋白,SmD1蛋白和SmD3蛋白中甲基化的精氨酸位于GRG三肽片段中,這說明精氨酸殘基前后一兩個位置上的氨基酸種類不同,可能影響其甲基化形式.(2)組蛋白上的甲基化修飾.組蛋白對于轉(zhuǎn)錄等過程至關(guān)重要,它是通過對其末端的化學(xué)修飾作用如磷酸化、乙?；图谆葏⑴c細胞核中生命活動.組蛋白賴氨酸和精氨酸的甲基化同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和異染色體的形成有關(guān).總之,組蛋白乙?；皆黾优c轉(zhuǎn)錄活性增強有關(guān),而組蛋白甲基化修飾的結(jié)果則相對復(fù)雜,它可以是轉(zhuǎn)錄增強或轉(zhuǎn)錄抑制.(ⅰ)組蛋白賴氨酸甲基化.組蛋白賴氨酸甲基化發(fā)生在H3-K4,H3-K9,H3-K27,H3-K36,H3-K79和H4-K20上,還可發(fā)生于H1N端.H3-K9,H3-K27H4-K20的甲基化與染色體的鈍化過程有關(guān),而H4-K9的甲基化可能與大范圍的染色質(zhì)水平的抑制有關(guān).H3-K4,H3-K36,H3-K79位的甲基化與染色體轉(zhuǎn)錄激活過程有關(guān),其中H3-K4的單甲基化修飾可以對抗H4-K9甲基化所導(dǎo)致的基因抑制.2001年,Hisashi等首先證明了組蛋白H3-K9甲基化和DNA甲基化的關(guān)聯(lián).對脈胞菌N.crassa中DNA甲基化缺陷的突變株進行基因掃描,鑒定出一個包含SET結(jié)構(gòu)域的基因dim-5.Dim-5是一個H3組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTase),其對H3-K9的甲基化能夠直接或間接通過一個對甲基化H3-K9位點有親和作用的介導(dǎo)子來結(jié)合DNA甲基化酶.2002年Jackson等對擬南芥kryptonite突變株的功能分析進一步證實了這一關(guān)系.Shi等人研究發(fā)現(xiàn),胺氧化酶的核同源物L(fēng)SD1(KIAA0601)可作為組蛋白去甲基化酶和轉(zhuǎn)錄共抑制子.LSD1專一地使組蛋白H3Lys4去甲基化.賴氨酸去甲基化反應(yīng)通過氧化反應(yīng)發(fā)生,產(chǎn)生甲醛.重要的是,LSD1經(jīng)RNAi抑制后,引起H3Lys4甲基化的增加和相應(yīng)的目標(biāo)基因的抑制,表明LSD1通過組蛋白去甲基化抑制轉(zhuǎn)錄.這個研究揭示了組蛋白甲基化是通過組蛋白甲基化酶和去甲基化酶進行動態(tài)調(diào)控的.(ⅱ)組蛋白精氨酸甲基化.組蛋白精氨酸甲基化位點為H3-R2,H3-R4,H3-R17,H3-R26,它們都可以增強轉(zhuǎn)錄.雖然人們早已了解組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,但尚未發(fā)現(xiàn)去甲基化酶.2004年,Cuthbert等提出了“deimination”的過程,即將組蛋白的精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼?用以拮抗在精氨酸上的甲基化.隨后,Wang等的研究顯示,PAD4(peptidylargininedeiminase4)通過將甲基精氨酸轉(zhuǎn)換成瓜氨酸,調(diào)節(jié)組蛋白精氨酸甲基化,同時生成甲氨.研究發(fā)現(xiàn)PADI4(peptidyargininedeiminase4,Wang等將其縮寫為PAD4)特異地作用于H3末端的精氨酸殘基R2,R8,R17和R26使之轉(zhuǎn)變?yōu)殡野彼?由PAD4介導(dǎo)的deimination過程阻止了由CARM1介導(dǎo)的精氨酸甲基化.雖然單甲基仍然可以進行deimination過程,精氨酸的二甲基化則阻礙了PAD4的deimination過程.在對內(nèi)源啟動子的體內(nèi)靶向?qū)嶒烇@示,PAD4可以抑制激素受體介導(dǎo)的基因活化.當(dāng)這個激素介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性降低時,PAD4被pS2啟動子“招募”.說明PAD4通過調(diào)節(jié)組蛋白精氨酸甲基化和瓜氨酸化來調(diào)控基因表達[53,54].Trojer等的研究確認了絲狀真菌Aspergillusnidulans中三種獨特的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTs),利用特異性抗體實驗證明體內(nèi)的組蛋白精氨酸上存在甲基化,同時A.nidulans中高水平的PRMTs對特定核心組蛋白具有專一性,說明這些酶在調(diào)節(jié)染色質(zhì)的活性中具有重要功能.研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)它們以GST融合蛋白的形式表達時,均顯示出固有的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性.其中精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶A(RmtA)和精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶C(RmtC)分別同人類蛋白質(zhì)PRMT1和PRMT5顯示出顯著的序列同源性,精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶B(RmtB)和人或鼠的PRMT3也有遠程相關(guān).天然的RmtA和重組的RmtA均特異地催化組蛋白H4-R3甲基化,且由重組RmtA催化的組蛋白H4甲基化,影響由p300/CBP催化的乙酰化.RmtB-GST融合蛋白特異地催化組蛋白H3,H4和H2A的甲基化.(3)蛋白質(zhì)甲基化在生命體中的作用.組蛋白上的甲基化,不僅在真核細胞染色質(zhì)的遺傳外修飾中占有中心地位,對細胞分化、發(fā)育、基因表達、基因組穩(wěn)定性及癌癥研究等均有深遠的影響.其他類型的甲基化及甲基化酶在生命體中也有十分重要的作用.蛋白質(zhì)甲基化的異?；蚣谆傅耐蛔兂?dǎo)致疾病的發(fā)生.例如單甲基化的精氨酸和不對稱二甲基化的精氨酸是氮氧合成酶NOS抑制劑,許多患有心血管疾病的人體內(nèi),已發(fā)現(xiàn)異于常人的這種氨基酸.精氨酸甲基化的不可逆性,可能使發(fā)生甲基化的蛋白質(zhì)影響NOS的活性.在自體免疫的疾病中,也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種甲基化的蛋白,如在患有多發(fā)性硬化疾病的患者體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了髓鞘堿蛋白的抗體.Chuikov等發(fā)現(xiàn)一個新的調(diào)節(jié)p53功能的機制,它是通過Set9催化的賴氨酸甲基化完成的.Set9特異性地甲基化p53的C端調(diào)節(jié)區(qū)域的一個殘基.甲基化的p53被限制在細胞核里,穩(wěn)定性增強.Set9以依靠p53甲基化位點的方式調(diào)節(jié)p53靶向基因的表達.Set9,p53和輔助因子產(chǎn)物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),提供了通過賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶識別p53的分子基礎(chǔ).1.6乙酰化和去乙?；阴；彩羌毎麅?nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要形式.組蛋白等許多蛋白都可以發(fā)生乙?；?(1)組蛋白動態(tài)乙?；揎?近年來,對于組蛋白乙?；难芯块_展較多.可逆的組蛋白乙?；揎椧寻l(fā)現(xiàn)40多年,發(fā)生在核心組蛋白N端的賴氨酸上.組蛋白的乙?；?是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)催化的,去乙?；山M蛋白去乙酰酶(histonedeacetylases,HDs或者HDACs)催化的.核心組蛋白N端的末端富含賴氨酸,生理條件下帶正電,它可與帶負電的DNA或相鄰的核小體發(fā)生作用,導(dǎo)致核小體構(gòu)象緊湊及染色質(zhì)高度折疊.乙?；菇M蛋白與DNA間的作用減弱,導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象松散,這種構(gòu)象有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的接近,從而可以和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,促進基因的轉(zhuǎn)錄.去乙酰化則抑制基因轉(zhuǎn)錄.人們認為,組蛋白N端結(jié)構(gòu)域的乙?；瘜?dǎo)致染色體局部解旋,這是DNA重新包裝的必要不充分條件.現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種不同的HATs和HDs,其中CBP/p300可能是最重要的,它可以和多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用.組蛋白乙?；腿ヒ阴；陌胨テ谥挥袔追昼?這種持續(xù)、快速的競爭性反應(yīng)的作用尚不清楚.同時,這種變化除了對乙?；礁叩偷目焖俎D(zhuǎn)換起作用外,它本身是否和染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄有關(guān)也不明了.有研究顯示,這種變化可能直接與基因轉(zhuǎn)錄有關(guān).正常被抑制的區(qū)域高乙?；蛘＞哂修D(zhuǎn)錄活性的區(qū)域去乙?；?都可以導(dǎo)致各種紊亂,誘發(fā)與發(fā)育、增殖相關(guān)的疾病,例如白血病、皮膚癌、脆性X染色體綜合征以及大拇指癥候群.Harel-Bellan詳細介紹了乙?；腿ヒ阴；^程中的異常導(dǎo)致的疾病,作者在此不再贅述.在體內(nèi),增強子活性的變化可以調(diào)節(jié)重組酶與染色體重組信號序列結(jié)合的能力從而調(diào)節(jié)V(D)J重組,但這個變化的分子機制尚不清楚.McMurry等研究了組蛋白H3乙?；瘜(D)J重組報告基因和T細胞受體α/δ位點的影響.實驗顯示了增強子活性在H3乙?；虚L期的調(diào)節(jié)作用,并且H3乙酰化水平與V(D)J重組緊密相連.由此,H3高乙?；赡苁锹?lián)系增強子活性與V(D)J重組能力的分子水平機制.多聚谷氨酰胺疾病是一種神經(jīng)退行性遺傳病,是由致病基因CAG重復(fù)片段的擴大引起的.研究顯示,在擴大的多谷氨酰胺誘導(dǎo)的疾病中,蛋白的乙酰化和去乙?；氖Ш馐且粋€關(guān)鍵的過程.通過遺傳學(xué)或藥理學(xué)的方法,減少相對酶組例如組蛋白去乙?；?可使平衡恢復(fù).隨著對HDACs研究的深入,使得特異的HDAC家族蛋白抑制劑的發(fā)展成為可能,并且這些化合物可以被有效地用到這些疾病的治療中.(2)其他蛋白上的乙酰化.在微管蛋白乙?；难芯恐?Hubbert等發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；窰DAC6能逆轉(zhuǎn)微管蛋白乙?；姆g后修飾.有證據(jù)顯示,降低微管蛋白乙?；潭?可以增強細胞的移動性,減少微管蛋白乙酰化的同時也減弱了微管的穩(wěn)定性.然而,Palazzo等研究發(fā)現(xiàn),微管的穩(wěn)定性與微管蛋白乙?；潭葲]有直接關(guān)系.細胞移動性的改變,是由于微管蛋白乙?；潭鹊牟煌斐傻?2004年,Nguyen等發(fā)現(xiàn)眼癌腫瘤抑制蛋白(pRb)的乙?；c細胞分化包括骨骼肌形成等相關(guān),提出乙?；梢哉{(diào)節(jié)pRb的特異性分化功能.眼癌腫瘤抑制蛋白可以誘導(dǎo)生長停滯和細胞分化.研究發(fā)現(xiàn),輔助激活因子p300可以乙?；郯┠[瘤抑制蛋白,但眼癌腫瘤抑制蛋白乙?；纳飳W(xué)作用還不清楚.p300相關(guān)因子(P/CAF)的乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)可與眼癌腫瘤抑制蛋白直接作用,調(diào)控眼癌腫瘤抑制蛋白的乙?；?同時,不同細胞的P/CAF也可相互作用.實驗顯示,乙?；挥绊懹裳郯┠[瘤抑制蛋白介導(dǎo)的生長停滯和E2F的轉(zhuǎn)錄抑制活性,相反,眼癌腫瘤抑制蛋白介導(dǎo)的細胞周期終止和成肌基因的表達都需要乙酰化的參與.2關(guān)于磷酸化與糖基化的作用機制在體內(nèi),各種翻譯后修飾過程不是孤立存在的.在很多細胞活動中,需要各種翻譯后修飾的蛋白共同作用.例如在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中,位于細胞膜外側(cè)的細胞外信息受體和相應(yīng)的響應(yīng)器(一般都是糖基化的蛋白質(zhì))與相應(yīng)的配體結(jié)合,