高級食品微生物學(xué)- 課件 第六章 食物中的常見真菌及其毒素

第六章食物中的常見真菌及其毒素Commonfungiandtheirtoxinsinfood1/34目錄CONTENTS2/34AspergillusflavusandaflatoxinsOchratoxinproducingbacteriaandochratoxin橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素Citrininproducingbacteriaandcitrinin其他真菌毒素Othermycotoxins赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素黃曲霉及黃曲霉毒素3/344/345/34真菌毒素的概述真菌毒素(mycotoxin)：是一類由真菌在食品或飼料中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，被人或動物攝入后能引發(fā)各種病害。目前已經(jīng)知道的有200多種不同的真菌毒素。根據(jù)真菌毒素作用的靶器官或引起的病理現(xiàn)象，可將其分為肝臟毒、腎臟毒、神經(jīng)毒、心臟毒、造血器官毒、震顫毒等真菌毒素最易污染的農(nóng)產(chǎn)品是玉米、花生和小麥。在我國研究得比較多的真菌毒素有黃曲霉毒素、單端孢霉烯族化合物中的脫氧雪腐鐮刀烯醇和T-2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬菌素B1、展青霉素、雜色曲霉等。概述6/34第一節(jié)黃曲霉及黃曲霉毒素黃曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）主要是由黃曲霉（A.flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）產(chǎn)生的高毒性次生代謝產(chǎn)物，是毒性和致癌性最強的天然污染物。在各類真菌毒素中，AF的重要性和危害性排在首位。其產(chǎn)生菌種主要有：黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉(A.nomius)產(chǎn)生。黃曲霉及黃曲霉毒素7/34一黃曲霉及其毒素對食物的侵染玉米、水稻、棉籽、花生、馬鈴薯等易染病。玉米染病在胚部生粗地毯狀或絮狀菌落，初為黃色，后變?yōu)辄S綠色，最后變成棕綠色。黃曲霉毒素是引起貯糧霉變發(fā)熱的主要貯糧病害。黃曲霉，屬半知菌亞門真菌。分生孢子頭，呈松針放射狀，分生孢子梗直立粗糙。頂囊近球形至燒瓶狀。單層小?；螂p層小便，同時生在一個頂囊分生孢子球形或近球形，大小3.5一6.5μm。生長適溫30℃，相對濕度85%。黃曲霉及黃曲霉毒素8/34黃曲霉病發(fā)生的基本條件是高溫潮濕，所以該病多發(fā)生于春夏之交。黃曲霉的生長及其毒素的產(chǎn)生受作物種類、真菌種類、環(huán)境中濕度及溫度、作物的水分含量和物理損傷情況的影響。干燥和貯存過程中的濕度、溫度和通風(fēng)是其中最重要的影響因素。一般相對濕度高于85%該苗生長快，毒素增加，籽粒含水量低于16%不生長，17%時生長緩慢，18%~19%生長迅速。降低花生對黃曲霉菌抵抗力從而造成黃曲霉毒素侵染的主要環(huán)節(jié)包括:

①花生栽培過程中受到的病蟲危害、收獲前期的干旱脅迫以及適時采收的錯過；②花生的收獲方式與晾曬干燥過程；③莢果入貯時病、殘、破損和枇果數(shù)量，貯藏過程中的莢果回潮情況、貯藏場所的溫度、貯藏期間的害蟲危害以及貯藏時間。黃曲霉及黃曲霉毒素9/34曲霉毒素生物合成模式黃曲霉毒素的生物合成需要多種酶的參與。編碼這些酶的基因和轉(zhuǎn)錄因子位于黃曲霉和寄生曲霉各自基因組的一個大約70kb大小的基因簇內(nèi)。黃曲霉毒素的生物合成以乙酰輔酶A（乙酰CoA）作為起始單位，丙二酸單酰CoA作為延長單位，在聚酮化合物合成酶（PKSA）的催化下形成聚酮骨架，之后在一系列的酶的催化下，最終成為黃曲霉毒素。二黃曲霉毒素的生物合成黃曲霉及黃曲霉毒素10/34黃曲霉毒素的生物合成受很多生物和非生物環(huán)境因素的影響：①碳源：單糖（如葡萄糖、蔗糖、果糖）和麥芽糖有利于黃曲霉毒素的形成，而山梨糖和乳糖則起抑制作用。部分植物多糖或真菌多糖作為碳源，對黃曲霉的數(shù)量和產(chǎn)毒均有影響。脂質(zhì)類的碳源有利于黃曲霉毒素的產(chǎn)生。②氮源：還原態(tài)氮源促進黃曲霉毒素的合成，氧化態(tài)氮源則起抑制作用。③溫度：寄生曲霉最佳生長溫度為25~35℃，超過最佳生長溫度，會影響毒素的生成。黃曲霉毒素最適產(chǎn)毒溫度為28~30℃，在36℃時產(chǎn)毒停止。④水分活度：當(dāng)水分活度低于0.90，黃曲霉無法生長。⑤pH：最佳pH為3.4~5.5。⑥生長發(fā)育狀態(tài)⑦氧化脅迫：氧化脅迫能夠誘導(dǎo)黃曲霉毒素的形成。⑧植物代謝產(chǎn)物黃曲霉及黃曲霉毒素三黃曲霉毒素生物合成的影響因素11/34囊泡理論與黃曲霉毒素的合成雙分支模型：①區(qū)域化：Nor-1、Ver-1和OmtA（三者均為黃曲霉毒素途徑相關(guān)的酶）在細胞質(zhì)游離核糖體中合成，包裝成運輸囊泡，通過細胞質(zhì)到液泡的靶向（CvT）途徑運送到液泡；

②基因調(diào)控：細胞感應(yīng)到葡萄糖濃度變化或葡萄糖代謝后，F(xiàn)adA/cAMP/PKA信號通路被激活囊泡化合成釋放激素的理論模型

四黃曲霉毒素的運輸與代謝黃曲霉及黃曲霉毒素12/34AFB1被稱為“前致癌物”，需要通過體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，“激活”其致癌性AFB1的代謝作用發(fā)生在肝臟AFB1的代謝途徑黃曲霉及黃曲霉毒素13/34

AFB1的毒性體現(xiàn)在肝臟中經(jīng)細胞色素P450活化的遺傳毒性，還體現(xiàn)在其在代謝過程中在細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧化簇(ReactiveOxygenSpecies,ROS)而造成的損傷黃曲霉毒素與癌癥和肝炎最強的致癌物-肝癌；黃曲霉毒素和HBV協(xié)同致癌。AFB1及其代謝產(chǎn)物致癌的分子機制主要是癌基因(如ras、c-fos)的激活和抑癌基因(如p53)的失活黃曲霉毒素與變異黃曲霉毒素與DNA、RNA和蛋白質(zhì)形成加合物，從而導(dǎo)致突變，同時也會引起脂質(zhì)過氧化作用黃曲霉毒素與生殖五黃曲霉毒素的毒性黃曲霉及黃曲霉毒素14/34阻斷和減少黃曲霉毒素的吸收：益生菌、腐殖酸、葉綠酸、葡甘露聚糖

干預(yù)藥物代謝酶調(diào)節(jié)黃曲霉毒素在體內(nèi)的代謝：

①許多中藥及其有效成分，例如黃岑、丹參、姜黃素、黃酮、多酚等，可作用于藥物代謝酶系統(tǒng)，進而影響黃曲霉毒素的代謝活化及解毒

②水果蔬菜中的香豆素、芐基異硫氰酸酯和3-羥甲基吲哚等可干預(yù)黃曲霉毒素在體內(nèi)的代謝

③一些抗氧化劑以及硒可干預(yù)黃曲霉毒素在體內(nèi)的代謝。黃曲霉及黃曲霉毒素六黃曲霉毒素吸收和代謝的干預(yù)生物吸附法：通過生物體（主要是微生物）吸附黃曲霉毒素。酵母細胞能結(jié)合90%的AFT，除酵母菌外,其它如乳酸菌、黑曲霉、葡萄梨頭菌等進行發(fā)酵處理,對去除糧食和飼料中AFT均可收到較好效果。生物酶解法：利用生物酶制劑，破壞黃曲霉毒素的毒性基團，將黃曲霉毒素降解為低毒或是無毒物質(zhì)被生物利用或是排出體外，達到去除黃曲霉毒素的目的。分為真菌降解和細菌降解兩大類生物提取物抑制法：從微生物或植物體內(nèi)提取的某些活性成分對黃曲霉具有抑制作用或能夠降解黃曲霉毒素。例如海帶多糖、馬鈴薯直鏈淀粉、香菇多糖，茶葉中的沒食子酸、表兒茶素、香豆素等15/34七黃曲霉毒素的脫毒黃曲霉及黃曲霉毒素16/34赭曲霉素是曲霉屬和青霉屬等一些菌屬所產(chǎn)生的一大類次級代謝物的統(tǒng)稱。是一種常見的污染食品的真菌毒素赭曲毒素A（OTA）是毒性最大的一類，對人類及動物健康造成很大威脅其產(chǎn)生菌種主要有：赭曲霉（AspeigrllusOeharceus）、疣孢青霉（Penicilliumverrucosum）和碳黑曲霉（Aspergilluscarbonarius）赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素第二節(jié)赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素17/34赭曲霉是最早發(fā)現(xiàn)OTA產(chǎn)生菌，生長溫度范圍為8~37℃，最佳生長溫度為30℃，最適水分活度為0.95~0.99，最適產(chǎn)OTA溫度為20℃，水分活度為0.99。疣孢青霉是另一種主要的OTA產(chǎn)生菌，生長溫度范圍0~31℃（最適20℃），水分活度0.95~0.98。一些黑曲霉也可產(chǎn)生褚曲霉素。碳黑曲霉以蘋果、葡萄為主要侵染對象，在30~35℃生長良好，最適產(chǎn)OTA溫度為15~20℃，水分活度為0.95~0.98。一赭曲霉素產(chǎn)生菌赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素18/34OTA產(chǎn)生菌廣泛分布于自然界，因此多種農(nóng)作物和食品，包括谷類、豆類及豆制品、干果、咖啡、葡萄及葡萄酒、香科、油料作物、啤酒、茶葉等均可被OTA污染。人通過進食被OTA污染農(nóng)作物和動物性食品而暴露OTA。由于反當(dāng)動物胃瘤中細菌產(chǎn)生一些酶可分解OTA，所以到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)在反芻動物組織中檢出OTA?？Х燃庸ぶ腥コХ纫蚝秃婵具^程可破壞90%以上OTA；在面粉加工過程中，碾磨可去除硬小麥中65%OTA，烹飪過程也可減少10%OTA。OTA在一定加工過程中可能被破壞或去除，在評價人類暴露OTA時最好以直接入口食品中OTA水平為準(zhǔn)。二赭曲霉素易污染的食物赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素19/34赭曲霉毒素A的生成機制OTA的苯基丙氨酸部分來自于莽草酸途徑，二氫異香豆素部分來自于聚五酮途徑。①一個乙酸鹽基團和四個丙二酸鹽基團經(jīng)聚酮合成酶的活化縮合在一起；②聚酮化合物長鏈經(jīng)過形成內(nèi)酯環(huán)和羰基化修飾，并由氯化物過氧化物酶將氯原子加入形成OTα；③OTA合成酶催化OTα連到苯基丙氨酸，合成OTA三赭曲霉毒素A的生成赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素20/34影響赭曲霉毒素A產(chǎn)生的因素產(chǎn)毒菌：涼爽環(huán)境下主要的OTA產(chǎn)毒菌是青霉屬真菌，在熱帶地區(qū)則主要為曲霉屬真菌。

菌對生長環(huán)境有選擇性，對不同的農(nóng)產(chǎn)品也有不同的偏好性，農(nóng)產(chǎn)品中真菌菌群的組成和可能產(chǎn)生的毒素都將因為貯藏時間和貯藏條件而發(fā)生改變。農(nóng)產(chǎn)品收獲時的環(huán)境，干燥條件及貯藏方式：谷物干燥的水分活度達到0.7以下，并且在貯藏過程中也保持該水平，能有效降低產(chǎn)毒菌的數(shù)量。除此之外，不同的農(nóng)產(chǎn)品因為所含營養(yǎng)物質(zhì)不同，因此侵染的菌株也有差異，這也會對OTA的產(chǎn)生條件有一定的影響。赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素21/34四

赭曲霉毒素的毒性急性毒性：癥狀主要表現(xiàn)為：①幾乎所有主要臟器多位點出血；②主要臟器纖維蛋白血栓；③肝臟和淋巴組織壞疽；④萎縮性腸炎；腎臟毒性：腎臟是OTA攻擊的主要靶器官，雄性的毒性大于雌性；神經(jīng)毒性：對大腦細胞的DNA有明顯氧化作用，抑制DNA氧化加合物的修復(fù)，降低大腦紋狀體多巴胺水平；免疫毒性：抑制免疫，促炎癥反應(yīng)。赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素22/34五

赭曲霉毒素的脫毒物理脫毒：吸附、輻照化學(xué)脫毒：對毒素進行化學(xué)修飾等使之變?yōu)椴痪叨拘缘奈镔|(zhì)生物脫毒：通過生物代謝或者酶促反應(yīng)降解毒素或者修飾毒素分子而達到脫毒的目的，具有脫毒效果好、對營養(yǎng)物質(zhì)無損傷、污染小、快速等特點

——乳酸菌（LactobacillusacidophilusVM20）、不動桿菌、酵母菌（Phaffia

rhodozyma）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）等屬的某些微生物菌株和某些曲霉屬真菌（A.fumigatus、A.niger），在體外顯示出>95%的OTA降解率，大多數(shù)的OTA降解產(chǎn)物為毒性較小的OTα。微生物菌群，如牛和羊的瘤胃，小鼠的大腸和盲腸，人的腸道微生物，在一定程度上均可降解OTA。食物加工中的脫毒：在特定的高溫、高酸、高堿及生物酶解下會發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變赭曲霉素產(chǎn)生菌與赭曲霉素橘青霉素（Citrinin）在橘青霉（Penicilliumcitrinum），一些青霉、曲霉中被發(fā)現(xiàn)，其中確定產(chǎn)生毒素的種屬有沙門柏干酪青霉（Penicilliumcamemberti）和米曲霉（Aspergillusoryzae）。橘青霉素在長時間儲存的食物如谷物和谷物制品、大米、果實（例如蘋果）、果汁、黑橄欖、烤堅果（如杏仁，花生，榛子，開心果）、葵花籽、香料（如姜黃、香菜、茴香、黑胡椒、豆蔻和小茴香）、奶酪、清酒、腐爛的蔬菜、肉食和其他食品補充劑等中均發(fā)現(xiàn)有污染。23/34一

橘青霉素的來源、分布和代謝橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素第三節(jié)橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素橘青霉素是一種天然產(chǎn)物，可從其天然來源中提取獲得，如產(chǎn)檸檬酸的真菌和受污染的食物。橘青霉素的化學(xué)合成步驟如下：3-(4,6-二羥基鄰位-甲苯基)丁醇被羧基化，并受到蓋特曼反應(yīng)的影響（在鋅存在下用氰化氫/氯化氫氯化物作為催化劑通過反應(yīng)將苯酚轉(zhuǎn)化為芳香醛）；隨后用硫酸環(huán)化形成橘青霉素，然后通過用乙醇結(jié)晶純化橘青霉素。橘青霉素也可通過將二羥基橘青霉素溴氧化的方法來合成。24/34橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素二

橘青霉素的生物合成和實驗室合成橘青霉素的化學(xué)合成橘青霉素是一種聚酮化合物霉菌毒素，分子量為250.25g/mol。它的熔點為溫度達到175-178.5℃。橘青霉素幾乎不溶于冷水，微溶于熱水，但可溶于氫氧化鈉，碳酸鈉或乙酸鈉水溶液，以及極性有機溶劑，如甲醇，乙腈，乙醇等。橘青霉素在高于175℃的干燥條件下或在高于100℃的有水情況下分解。結(jié)構(gòu)上橘青霉素是具有兩個分子內(nèi)氫鍵的醌，以無序結(jié)構(gòu)結(jié)晶，其中對醌和對苯二酚互變異構(gòu)形式，處于固態(tài)的動態(tài)平衡，具有共軛的平面結(jié)構(gòu)，為其提供自然熒光；最高的熒光是由pH值為2.5的非離子化橘青霉素分子產(chǎn)生。pH是調(diào)節(jié)橘青霉素攝取、抗真菌活性和抑制細胞呼吸的重要因素。25/34橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素三

橘青霉素的物理化學(xué)性質(zhì)抗菌活性毒理作用：橘青霉素作為一種腎毒素,對于不同物種的急毒性不同，能夠與人血液中的蛋白結(jié)合，從而影響人體健康；氧化應(yīng)激和抗氧化酶的修飾（例如谷胱甘肽和轉(zhuǎn)氫酶）被認為是生物系統(tǒng)中橘青霉素引發(fā)毒性作用的兩個主要原因；橘青霉素的急性細胞毒性可能是其慢性毒性的機制之一；橘青霉素對心臟、生殖系統(tǒng)及其他器官也具有不利影響致癌性、遺傳毒性和誘變效應(yīng)26/34橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素四

橘青霉素的生物學(xué)活性真核測試系統(tǒng)中CIT介導(dǎo)的細胞遺傳毒性作用機制針對目前紅曲產(chǎn)品中的橘青霉素含量不同程度地超出各個國家的限量標(biāo)準(zhǔn)，為了控制紅曲產(chǎn)品中的橘青霉素同時高產(chǎn)紅曲色素，已從誘變、篩選、改造菌株、改良生產(chǎn)工藝、優(yōu)化發(fā)酵條件等方面進行了大量的工作。菌株：在菌種方面，紅色紅曲霉和單色紅曲霉都不產(chǎn)橘青霉素。根據(jù)不同的菌株產(chǎn)橘青霉素的能力差距較大，通過菌株篩選、環(huán)境誘變育種（紫外、化學(xué)、高能混合粒子場、超聲波、氯化鋁等誘變方法）、基因工程技術(shù)（關(guān)鍵基因敲除法、構(gòu)建T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫）等改良紅曲菌株，選育不產(chǎn)或者低產(chǎn)橘青霉素的優(yōu)良菌種用于生產(chǎn)紅曲色素。27/34橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素五

橘青霉素合成的控制——以紅曲產(chǎn)品為例培養(yǎng)工藝：紅曲菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，受到菌株、培養(yǎng)環(huán)境條件和培養(yǎng)基組分的影響，通過研究改變紅曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)工藝如pH值、通氧量、水分、溫度和光照、碳氮源的種類及其配比、外加添加物等方法，優(yōu)化發(fā)酵工藝以期提高紅曲霉色素產(chǎn)量的同時，抑制紅曲霉發(fā)酵代謝產(chǎn)生橘青霉素的合成量。代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：紅曲霉代謝是動態(tài)的，隨著培養(yǎng)工藝的變化，紅曲色素和橘青霉素生成量不同，采用差異蛋白組學(xué)研究發(fā)酵工藝對紅曲霉分泌蛋白表達的影響，鑒定及分析紅曲色素和橘青霉素關(guān)鍵酶系及其活性變化規(guī)律，闡明代謝過程中紅曲色素和橘青霉素合成的影響規(guī)律及其相關(guān)性，有望根據(jù)相關(guān)結(jié)果減少生產(chǎn)過程中橘青霉素的產(chǎn)量。28/34橘青霉素生產(chǎn)菌與橘青霉素伏馬菌素是一組由串珠鐮孢(Fusariummoniliforme)、輪狀鐮孢(F.verticilioides)、多育鐮孢(F.proliferatum)和其它一些鐮孢菌種產(chǎn)生的真菌毒素。伏馬菌素有11種，其中FB1是伏馬菌素B的主要組分，毒性最強。伏馬菌素主要污染玉米。串珠鐮孢是是全世界玉米中分布最廣泛的一類真菌。伏馬菌素具有神經(jīng)毒性、肝和腎毒性、免疫毒性、致癌性等。伏馬菌素屬于鐮刀菌毒素，其致毒機制可能是毒素破壞神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)的生物合成。29/34其他真菌毒素第四節(jié)其他真菌毒素一

伏馬菌素麥角生物堿（ergotalkaloids，EA）簡稱麥角堿，是由麥角菌屬（Clavicepspurpurea）的霉菌感染黑麥、小麥、燕麥、高粱等谷類作物及牧草后產(chǎn)生的毒素。一般被麥角菌屬感染后的農(nóng)作物，會出現(xiàn)黑色的菌絲。麥角生物堿的活性成分主要是以麥角酸為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的一系列生物堿衍生物，如麥角胺（ergotamine）、麥角新堿（ergonovine）、麥角毒堿（ergotoxin）、麥角生堿（ergosine）、麥角克堿（ergocristine）等。麥角堿的危害廣泛，可引起農(nóng)作物減產(chǎn)，食用了被毒素污染的食品能導(dǎo)致人類及家畜中毒，造成經(jīng)濟損失。麥角生物堿的毒性效應(yīng)主要作用于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。30/34其他真菌毒素二

麥角生物堿單端孢霉烯族化合物是由頭孢菌（Cephalosporium）、鐮刀菌（Fusarium）、葡萄狀穗霉（Stachybotrys）和木霉菌（Trichoderma）等代謝產(chǎn)生的一組生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的有毒物質(zhì)，均具有四環(huán)倍半萜烯結(jié)構(gòu)。引起食品污染的單端孢霉烯族化合物主要有2個類群：1）以