第二章 基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶分類：限制性內(nèi)切酶（RestrictionEndonuclease）RNaseA1.水解酶類核酸酶RNaseT1RNaseHDNaseⅠS1核酸外切酶（Exonuclease）

大腸桿菌DNA聚合酶（DNAPolⅠ)大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（KlenowFragment|）

2.DNA聚合酶類嗜熱DNA聚合酶（Taq酶）DNA連接酶(Ligase)反轉(zhuǎn)錄酶（ReverseTranscriptase)

小牛腸堿性磷酸酶(CIP)3.修飾酶類細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)T4噬菌體多核苷酸激酶

（T4PhagePolynucleotideKinase)鼠源禽源（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（四）II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)條件一、限制性核酸內(nèi)切酶由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象---20世紀(jì)60年代，Linn和Arber發(fā)現(xiàn)(B)(K)大腸桿菌B大腸桿菌KEOP=1EOP=1EOP=10-4EOP=10-4EOP成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA（一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制和修飾現(xiàn)象限制—修飾的酶學(xué)系統(tǒng)(B)(B)酶切位點(diǎn)不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點(diǎn)被修飾基因組DNA不被切割

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。1962年瑞士的W.Arber（阿爾伯）提出細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)。1968年發(fā)現(xiàn)Ⅰ型內(nèi)切酶;1968年美國(guó)的H.O.Smith發(fā)現(xiàn)Ⅱ型內(nèi)切酶;1970年美國(guó)的O.Nathans（內(nèi)申斯）用Ⅱ型酶制備了腫瘤基因;1978年三人共獲諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。從此，相關(guān)研究展開。目前已純化出3000種限制性內(nèi)切酶中，其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的。概念:限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是3,5-磷酸二酯鍵。（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性

特性1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點(diǎn)5.特異性切割6.基因克隆中I型雙功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點(diǎn)5‘端至少1000bp不是（隨機(jī)）無(wú)用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+位于識(shí)別位點(diǎn)上是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處是用處不大（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體字母的略語(yǔ)表示酶來(lái)源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichiacoli表示為Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示為

Hin；2、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系，則用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如EcoRI、HindIII。EcoRⅠ（酶名稱）:EscherichiaColiRnisⅠ

屬名種名株系編號(hào)（四）II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點(diǎn)1、識(shí)別位點(diǎn)的特異性每種酶都有其特定的DNA識(shí)別位點(diǎn)，通常是由4～8個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、識(shí)別序列的對(duì)稱性

靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性

交錯(cuò)切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。能識(shí)別外源DNA并將其水解的內(nèi)切核酸酶，是細(xì)菌對(duì)外源DNA的防御機(jī)制。幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念粘性末端cohesiveends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。平末端Bluntend在識(shí)別序列對(duì)稱處同時(shí)切開DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。

同裂酶isoschizomers

能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來(lái)源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對(duì)位點(diǎn)的甲基化敏感性有差別。同尾酶isocaudamers

識(shí)別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如BamHI、BclI、BglII和XhoI是一組同尾酶。

平齊末端帶5’－P端的黏性末端帶3’－OH和5’－P端的平末端例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，識(shí)別順序都是

5’……C|CG

G……3’

3’……G

GC|C……5’

如果其中有5’-甲基胞嘧啶，HpaⅡ不能夠切割，MspI能切割。

同裂酶切割DNA時(shí)，產(chǎn)生相同的粘末端，故被切割得DNA可重組并且重組后產(chǎn)生兩種情況A.B,如圖：MobIBamHIBglII5’…NGATCN…3’5’N…GGATCC…N3’5’N…AGATCT…N3’3’…NCTAGN…5’3’N…CCTAGG…N5’3’N…TCAAGA…N5’5’…NGATCC…N3’5’N…GGATCT…N3’3’…NCTAGG…N5’3’N…CCTAGA…N5’5’N…GATCC…N3’5’…NGCATCT…N…3’CTAGG…N5’CGTAGA…N…5’A:可被MobI識(shí)別切割，但不被B:重組DNA,-不能被上述酶識(shí)別BamHI識(shí)別切割。與切割。注意限制性內(nèi)切酶對(duì)外源DNA的作用無(wú)種屬特一性：對(duì)不同的外援DNA,只要有酶的識(shí)別順序即可切割DNA產(chǎn)生相同的粘末端或平截末端，據(jù)此可進(jìn)行DNA的重組。在A情況下產(chǎn)生的重組體只能被一種酶消化，減少了可逆反應(yīng)，提高了重組率。轉(zhuǎn)化后還可以用可消化的那種酶(MobⅠ)進(jìn)行酶切鑒定。在B情況下，產(chǎn)生重組體。不能再被兩種酶識(shí)別，消除了可逆反應(yīng)，效率更高。但轉(zhuǎn)化后不能再用這兩種酶鑒定。通常選A的情況。4.不具有甲基化功能

II型限制性核酸內(nèi)切酶的甲基化修飾作用由相應(yīng)的甲基化酶承擔(dān)。5.對(duì)單鏈DNA的切割切割效率較低。酶活單位

一個(gè)限制酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37℃）下，1h內(nèi)中完全降解1gDNA所需要的酶量。

（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)酶切反應(yīng)的基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應(yīng)液CKMBuffer(10×)2.0

LddH2O

約16.5

LDNA0.2~1.0

gEnzyme1～2UVolume20.0

L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT①反應(yīng)體系②混勻③最適溫度,酶量,時(shí)間,反應(yīng)終止④電泳鑒定結(jié)果在“非最適的”反應(yīng)條件下,有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號(hào)活性，用*表示。

限制性內(nèi)切酶的第二活力（Secondaryactivity，又稱星號(hào)活力）指改變了酶的反應(yīng)條件，使酶原有的識(shí)別特異性的降低。例如：EcoRI的典型特異性是核苷酸序列GAATTC，當(dāng)改變此酶的反應(yīng)條件時(shí)，他的特異性由原來(lái)的6核苷酸降低為四核苷酸AATT。星號(hào)活力的產(chǎn)生可為酶提供新的序列特異性，這些活性在某些情況下可能是有用的，但是很少導(dǎo)致第二識(shí)別位點(diǎn)的完全或同等的切割，因此為了避免星活力的出現(xiàn)，所有限制性酶切反應(yīng)均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下，通常反應(yīng)條件通過(guò)緩沖液控制。（六）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素影響酶活性的因素很多，最重要的有：⑴酶純度⑵DNA的純度⑶DNA的甲基化程度⑷酶切反應(yīng)的溫度與時(shí)間⑸DNA的分子結(jié)構(gòu)⑹限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液

（1）酶純度引起某些酶活力變化的因素較多，包括甘油的濃度，離子的濃度，PH值，有機(jī)溶劑的存在，二價(jià)陽(yáng)離子過(guò)高的酶和DNA濃度的比例。（2）DNA純度

鉑，酚，氯仿，酒精，EDTA，SDS，鹽離子等均影響酶活性。純度不高，含有蛋白，特別是DNase加入Buffer時(shí)因有Mg2+，而激活降解DNA樣品，而無(wú)特異帶。解決辦法：擴(kuò)大反應(yīng)體積20

L—50

L延長(zhǎng)酶作用時(shí)間1h—數(shù)小時(shí)增加酶用量1u—10u

（3）DNA甲基化程度甲基化程度高不被大多數(shù)限制性內(nèi)切酶切割，解決辦法是：選用無(wú)甲基化酶的突變菌株；使用對(duì)甲基化酶堿基無(wú)切割能力的酶（對(duì)哺乳動(dòng)物DNA）。（4）酶切反應(yīng)的溫度與時(shí)間所有限制性內(nèi)切酶均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行，大多數(shù)最適反應(yīng)溫度是37℃，少數(shù)耐熱TaqⅠ是65℃；SmaⅠ是25℃（30℃）。反應(yīng)時(shí)間與酶量有關(guān)。（5）DNA分子的構(gòu)型不同構(gòu)型的影響很大：消化超螺旋環(huán)狀DNA用的酶量大于線性DNA不同位點(diǎn)切割能力不同（6）限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液Mg2+，Tris-HCl，NaCl或KCl?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性)BSA（牛血清白蛋白）穩(wěn)定酶蛋白。（七）其它水解核酸的酶1.水解RNA的核酸酶(Rnase):種類很多介紹五種酶名稱來(lái)源最適PH作用特點(diǎn)反應(yīng)式應(yīng)用RNaseA胰臟7.9切嘧啶產(chǎn)生ApUpCpNpRNA測(cè)序3’p嘧啶核苷酸或以其結(jié)ApUp+Cp+Np尾的寡核苷酸RNaseT1米曲霉4.5切G產(chǎn)生3’GpGpGpApCpGp同上或以其為結(jié)尾的寡核苷酸Gp+Gp+ApCpGpRNaseU2黑曲霉4.5切A產(chǎn)生3‘APGpApCpApAp同上或以其結(jié)尾的寡核苷酸片段GpAp+CpAp+ApRNasephy頭絨孢菌不切C產(chǎn)生3’Ap,GpApCpUpGp同上3’Gp,3’Up或以其為結(jié)尾片段GpApCpUpGpRNaseH大腸桿菌水解DNA-RNA雜交分子中的RNA2核酸酶S來(lái)自稻谷曲霉高度特異性于單鏈核酸的內(nèi)切酶：可催化單鏈RNA或DNA，降解成5’單核苷酸。同時(shí)也可作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)（小到一個(gè)堿基）。作用：測(cè)定雜交分子（DNA-DNA)或(RNA-DNA)的雜交程度，即使是一對(duì)堿基沒(méi)雜交也能檢測(cè)到。cDNA合成時(shí)去掉第一連與第二連的發(fā)夾結(jié)構(gòu)測(cè)定DNA上內(nèi)含子的位置

（一）DNA連接酶的概念與作用機(jī)制（二）連接酶種類及特性的比較

（三）DNA連接酶作用的特點(diǎn)（四）DNA連接酶的反應(yīng)條件（五）影響連接反應(yīng)的因素DNA連接的策略（六）T4DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和載體連接的一般方案二、DNA連接酶及其應(yīng)用DNA重組的核心技術(shù)：DNA片段之間的體外連接——連接酶。（一）DNA連接酶的概念與作用機(jī)制環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。

首個(gè)DNA連接酶(ligase)——1967年，大腸桿菌DNA連接酶，是大腸桿菌基因編碼

。1970年，發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶，

由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。概念：DNA連接酶（Ligase）能夠催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶。DNA連接酶的催化反應(yīng)DNAligase+NAD+/ATP↓酶-AMP復(fù)合物↓+DNAAMP-DNA↓相鄰3’-OH對(duì)活化的磷原子發(fā)生親核攻擊↓→AMP3’,5’-磷酸二酯鍵DNA連接酶連接的作用機(jī)制（二）連接酶種類及特性的比較

最常用（三）DNA連接酶作用的特點(diǎn)A.

連接的兩條鏈必須分別具有自由3’-OH和5’-P，而且這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰；B.在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過(guò)程。E.coliDNA連接酶－連接具互補(bǔ)堿基黏性末端(最初研究表明），現(xiàn)在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。T4DNA連接酶－連接具互補(bǔ)堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。

是雙鏈－因此不能將兩條單鏈連接起來(lái)或使單鏈環(huán)化起來(lái)。

OHP××是相鄰的－因此不能封閉gap，只能封閉nick.gapNONickOK（四）T4DNA連接酶連接反應(yīng)的條件連接酶反應(yīng)體系體系T載體粘末端平末端10×Buffer1μL1/2μL1/2μLvector50ng3-30fmol15-60fmolInsertfragment100ng9-90fmol45-180fmolLigase