青霉素生產(chǎn)工藝

青霉素生產(chǎn)工藝摘要：青霉素是人類(lèi)最早發(fā)現(xiàn)的抗生素，其殺傷革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的神奇功效幾乎人人都曾領(lǐng)教過(guò)。它的發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物學(xué)乃至整個(gè)人類(lèi)發(fā)展的重要意義可以說(shuō)是有口皆碑，以致于人們把青霉素的發(fā)現(xiàn)使用列入二十一世紀(jì)給人類(lèi)生活帶來(lái)巨大變化的科技貢獻(xiàn)。本文將對(duì)青霉素的生產(chǎn)工藝及其提取進(jìn)行深入的講解。關(guān)鍵詞：青霉素生產(chǎn)工藝發(fā)酵提取一、 前言青霉素又被稱(chēng)為青霉素G、盤(pán)尼西林、配尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類(lèi)抗生素，是第一種能夠治療人類(lèi)疾病的抗生素。青霉素類(lèi)抗生素是P-內(nèi)酰胺類(lèi)中一大類(lèi)抗生素的總稱(chēng)。1929年英國(guó)學(xué)者弗萊明首先在抗生素中發(fā)現(xiàn)了青霉素，英國(guó)謝菲爾德大學(xué)病理學(xué)家弗洛里實(shí)現(xiàn)對(duì)青霉素的分離與純化，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)傳染病的療效，與英國(guó)生物化學(xué)家錢(qián)恩共獲1945年諾貝爾獎(jiǎng)。青霉素分為天然的和半合成的，天然的青霉素是通過(guò)菌種發(fā)酵得到的。本文在簡(jiǎn)述青霉素作用的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)青霉素的工藝流程和精制提取青霉素進(jìn)行詳細(xì)的講解。二、 青霉素的生物學(xué)特性青霉素類(lèi)抗生素是P-內(nèi)酰胺類(lèi)中一大類(lèi)抗生素的總稱(chēng)，由于P-內(nèi)酰胺類(lèi)作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，而人類(lèi)只有細(xì)胞膜無(wú)細(xì)胞壁，故對(duì)人類(lèi)的毒性較小，除能引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)外，在一般用量下，其毒性不甚明顯，但它不能耐受耐藥菌株（如耐藥金葡）所產(chǎn)生的酶，易被其破壞，且其抗菌譜較窄，主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效。青霉素G有鉀鹽、鈉鹽之分，鉀鹽不僅不能直接靜注，靜脈滴注時(shí)，也要仔細(xì)計(jì)算鉀離子量，以免注入人體形成高血鉀而抑制心臟功能，造成死亡。三、 青霉素生長(zhǎng)菌青霉素最初是從點(diǎn)青霉素產(chǎn)生，生產(chǎn)能力很低，后來(lái)找到適于深層培養(yǎng)的產(chǎn)黃青霉菌，經(jīng)一系列的誘變、雜交、育種，才得到高產(chǎn)的菌種。目前國(guó)內(nèi)青霉素的生產(chǎn)菌種按菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種。絲狀菌和球狀菌對(duì)原材料和培養(yǎng)條件的要求有一定的差別，產(chǎn)生青霉素的能力也有差異。球狀菌的發(fā)酵單位雖高，但對(duì)原材料和設(shè)備要求較高，且提煉收率也低于絲狀菌，因此國(guó)內(nèi)青霉菌生產(chǎn)廠大都采用綠色絲狀菌。

四、青霉素的發(fā)酵青霉素的發(fā)酵屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程一般分為菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成和菌體自溶三個(gè)階段。在菌體生長(zhǎng)階段，碳源和氮源等被分解代謝，濃度明顯下降，菌體進(jìn)行合成代謝。隨著菌體濃度的不斷增加，攝氧率也不斷增大，溶氧濃度不斷下降。當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，菌體濃度降至最小。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降到一定水平時(shí)，其中某一參數(shù)可能成為菌體生長(zhǎng)的限制性因數(shù)，使菌體生長(zhǎng)速率減慢。同時(shí)，在大量合成菌體期間，積累了相當(dāng)量的某些代謝中間體，原有酶的活力下降，出現(xiàn)了與次級(jí)代謝有關(guān)的酶或其酶被解除了控制，導(dǎo)致菌體的生理狀況發(fā)生改變，發(fā)酵就從菌體生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)物合成階段。這個(gè)階段一般稱(chēng)為菌體生長(zhǎng)期或發(fā)酵前期。在產(chǎn)物合成階段，產(chǎn)物的生成量逐漸增多，直至達(dá)到高峰，生產(chǎn)速率也達(dá)到最大，直至產(chǎn)物合成能力減退。在這個(gè)階段，菌體的呼吸強(qiáng)度一般無(wú)顯著變化，菌體物質(zhì)的合成仍未停止，菌體的質(zhì)量有所增加，但此時(shí)菌體細(xì)胞基本不繁殖。這個(gè)階段的代謝變化是以碳源和氮源的分解代謝和產(chǎn)物的合成代謝為主，碳、氫等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，產(chǎn)物不斷被合成。外界的環(huán)境變化很容易影響這個(gè)階段的代謝。碳源、氮源和磷酸鹽等的濃度必須控制在一定的范圍內(nèi)，發(fā)酵條件也要嚴(yán)格控制，才能促使產(chǎn)物不斷被合成。在菌體自溶階段，菌體開(kāi)始衰老，細(xì)胞開(kāi)始自溶，培養(yǎng)基中碳、氮含量增加，PH上升，產(chǎn)物合成能力衰退，生產(chǎn)速率下降。發(fā)酵到此必須結(jié)束，否則產(chǎn)物不僅受到破壞，還會(huì)因菌體自溶而給發(fā)酵液的過(guò)濾和提取帶來(lái)困難。青霉素生產(chǎn)菌不同，發(fā)酵工業(yè)也有區(qū)別。25C，6?7d)25C，40?45h)6?7d)f放罐25C，6?25C，6?7d)25C，40?45h)6?7d)f放罐25C，6?8d)28C，50?球狀菌的青霉素發(fā)酵工藝流程：冷凍管f斜面母瓶（孢子培養(yǎng)，f大米孢子斜面（孢子培養(yǎng)，25C，8?10d）f種子罐（種子培養(yǎng)，60h）f發(fā)酵罐（發(fā)酵，26C，6?7d）f放罐青霉素的分批發(fā)酵分為菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成兩個(gè)階段，進(jìn)入合成階段的必要條件是降低菌絲的生長(zhǎng)速率。影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的因素有環(huán)境和生理因素兩個(gè)方面，前者包括溫度、PH、培養(yǎng)基種類(lèi)及濃度、溶解氧飽和度等；后者包括菌體濃度、菌體生長(zhǎng)速率、菌絲形態(tài)等。菌體生長(zhǎng)和青霉素合成最適溫度并不相同，一般前階段略高于后階段。因此，在菌體生長(zhǎng)階段可以采取較高溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間，而到達(dá)產(chǎn)物合成階段，應(yīng)適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素的合成。青霉素發(fā)酵的最適PH一般在6.5左右，由于青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解，因此應(yīng)盡量避免 PH超過(guò)7.0。五、青霉素的提取1、 發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液預(yù)處理是抗生素分離純化的第一道工序。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中抗生素的濃度通常很低，而雜質(zhì)的含量通常很高，包括有大量的菌體細(xì)胞、未用完的培養(yǎng)基、各種蛋白質(zhì)膠狀物以及其他代謝產(chǎn)物等。發(fā)酵液預(yù)處理主要去除兩大類(lèi)物質(zhì)：一類(lèi)是可溶性物質(zhì)，包括核酸、雜蛋白質(zhì)、不溶性多糖等，這些雜質(zhì)不僅使發(fā)酵液粘度提高，影響液固分離速率，而且還會(huì)影響提取操作；另一類(lèi)是某些無(wú)機(jī)鹽，它們不僅影響成品質(zhì)量，而且在采用離子交換法提取時(shí)，由于樹(shù)脂大量吸附無(wú)機(jī)離子而減少對(duì)抗生素的交換，因此，應(yīng)將這些無(wú)機(jī)離子，特別是高價(jià)金屬離子除去。發(fā)酵液放罐后，首先要冷卻，因?yàn)榍嗝顾卦诘蜏貢r(shí)比較穩(wěn)定，細(xì)菌繁殖也比較慢，可避免青霉素迅速被破壞。青霉素菌絲教粗，一般過(guò)濾較容易，通常采用鼓式過(guò)濾及板框過(guò)濾；蛋白質(zhì)的處理方法包括等電點(diǎn)沉淀、變性沉淀、沉淀劑沉淀、凝聚劑沉淀、絮凝劑沉淀；吸附、酶解法去除不溶性多糖等；高價(jià)金屬離子的去除方法有離子交換法和沉淀法等。2、 青霉素的提取青霉素的提取方法包括離子交換法、吸附法、沉淀法和溶劑萃取法等。離子交換法利用離子交換樹(shù)脂作為吸附劑，將青霉素從發(fā)酵液中吸著在樹(shù)脂上，然后在適宜的條件下洗脫下來(lái)，達(dá)到分離、濃縮、提純的目的。由于離子交換法具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、不用或少用有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)，已成為提取抗生素的重要方法之一。隨著大網(wǎng)格聚合物吸附劑的合成和發(fā)展，吸附法重新為抗生素工業(yè)所重視而獲得應(yīng)用。吸附法具有操作簡(jiǎn)便、安全、設(shè)備簡(jiǎn)單、不用或少用有機(jī)溶劑、生產(chǎn)過(guò)程中PH變化小等優(yōu)點(diǎn)。但吸附法選擇性差，收率不高。常規(guī)吸附劑按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為兩大類(lèi)；一類(lèi)是有機(jī)吸附劑，如活性炭、纖維素、大孔樹(shù)脂等；另一類(lèi)是無(wú)機(jī)吸劑，如氧化鋁、硅膠、硅藻土、碳酸鈣等。沉淀法是利用抗生素在一定的PH條件下，與某些金屬離子或其他化合物的整個(gè)分子結(jié)合成難易溶解的鹽或復(fù)鹽沉淀出來(lái)，以達(dá)到濃縮和提純的目的。利用某些抗生素具有兩極化合物的性質(zhì)，使其在等電點(diǎn)時(shí)從水溶液中游離而沉淀出來(lái)，直接得到成品。根據(jù)抗生素的理化性質(zhì)、提取工藝條件和所得沉淀物的情況，沉淀法一般可分為間接沉淀法和直接沉淀法兩種類(lèi)型。溶劑萃取法按操作方式可以分為單級(jí)萃取和多級(jí)萃取，后者又可以分為錯(cuò)流萃取和逆流萃取。單級(jí)萃取只包括一個(gè)混合器和一個(gè)分離器。料液經(jīng)萃取后的萃取液再用新鮮萃取劑進(jìn)行萃取稱(chēng)為多級(jí)錯(cuò)流萃取。溶劑萃取法提取青霉素的效果除了已選定已選定適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑、破乳化劑和離心分離設(shè)備外，還與 PH、溫度和萃取方式及濃縮比等因素有關(guān)。青霉素在酸性條件下極易被水解破壞，生成青霉素酸，但根據(jù)PK值的要求，又一定要在酸性時(shí)才能將青霉素轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中，因此合適的PH很重要。在中性PH下青霉素以成鹽的形式溶于水中，轉(zhuǎn)移也較完全。如果堿性過(guò)強(qiáng)，則已發(fā)生堿性水解，而且雜質(zhì)也易轉(zhuǎn)到水相中，質(zhì)量也較差。在低溫條件下提取青霉素較為有利，并且提取過(guò)程中停留的時(shí)間越短越好。青霉素在丁酯中于0?15°C放置24h不致?lián)p失效價(jià)，但在溫室下效價(jià)損失可達(dá)5.32%。萃取方式和濃縮比也有很大影響，根據(jù)萃取方式和理論收得率的計(jì)算得知，多級(jí)逆流萃取較理想，目前生產(chǎn)上采用二級(jí)逆流萃取方式。濃縮比的選擇也很重要，因?yàn)槎□サ挠昧颗c收率和質(zhì)量都有關(guān)系。若丁酯用量太多，雖然萃取較完全、收率高，但達(dá)不到結(jié)品濃度要求，反而增加溶劑的耗用量；若丁酯用量太少，則萃取不完全，影響收率。六、抗生素的精制1、 濃縮在抗生素提取和精制的過(guò)程中，常需要通過(guò)蒸發(fā)將發(fā)酵濾液或提取液進(jìn)一步濃縮，以利于后序操作?？股厣a(chǎn)中有真空濃縮和薄膜蒸發(fā)濃縮。2、 干燥干燥的目的是除去抗生素中所含的水分，以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品的加工、儲(chǔ)存和使用。常用的干燥方法有減壓干燥、噴霧干燥、氣流干燥、冷凍十燥等。此外也有使用常壓干燥、固定床干燥及紅外線干燥等。3、 脫色和去熱原提煉往往是注射用抗生素提取中不可缺少的一個(gè)單元操作。這一步操作的好壞，不僅影響下一道工序，更重要的是關(guān)系到成品的色極及熱原試驗(yàn)等質(zhì)量指標(biāo)。用活性碳可除去各種色素，同時(shí)也能出去熱原。4、 結(jié)晶抗生素的精制過(guò)程中常常通過(guò)結(jié)品的方法來(lái)制得較高純度的成品?？股氐木品椒ê芏啵a(chǎn)中常用的結(jié)品方法有以下幾種：改變溫度結(jié)品、利用等電點(diǎn)結(jié)品、加成鹽劑結(jié)品、加入不同溶劑結(jié)品、共沸結(jié)品。另外還有鹽析法、中間鹽轉(zhuǎn)移法、品體洗滌法等幾種精制方法。重結(jié)品是進(jìn)一步提純精制抗生素的有效方法，通過(guò)重結(jié)品方法可獲得高純度抗生素產(chǎn)品。七、結(jié)論發(fā)酵罐是現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)的象征，它是微生物在發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)、繁殖和形成產(chǎn)品的外部環(huán)境裝置，它取代了傳統(tǒng)的發(fā)酵容器：培養(yǎng)瓶、醬缸和酒窖，它能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，最大限度地利用原料和設(shè)備，獲得高產(chǎn)量和高效率。對(duì)青霉素生產(chǎn)的改進(jìn)得益于來(lái)自于生物化學(xué)、遺傳學(xué)、微生物生理學(xué)以及生化工程等方面科技人員的共同努力。迄今為止，人們對(duì)青霉素生物合成的了解還十分膚淺，大部分機(jī)理仍還無(wú)法闡述清楚，然而可以預(yù)計(jì)，隨著對(duì)青霉素發(fā)酵過(guò)程和代謝途徑認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們一定能夠找到某種適當(dāng)?shù)霓k法來(lái)解決青霉素合成中的阻遏因素，從而大幅度提高青霉素的效價(jià)和產(chǎn)量。參考文獻(xiàn)1、 宇龍江.發(fā)酵工程原理與技術(shù)應(yīng)用.2006年9月第一版.2、 程殿林.微生物技術(shù)工程技術(shù)原理.2007年5月第一版.3、 黃儒強(qiáng)，李玲.生物發(fā)酵技術(shù)與設(shè)備操作.2006年9月第一版.4、 童海寶.生物化工.2001年一月第一版.5、 華北制藥廠技術(shù)情報(bào)組.六十年代以來(lái)國(guó)外青霉素發(fā)酵工藝研究.中國(guó)抗生素雜志，1997，(03).6、 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