-干擾素對流產(chǎn)大鼠son、an、室旁核nf-表達的影響

-干擾素對流產(chǎn)大鼠son、an、室旁核nf-表達的影響

ifn是th1中的一個吸引人因素。這是t移植激活和天然雜交細胞（nk）激酶后的產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)抗炎性和免疫反應(yīng)功能。高劑量IFN-γ不利于妊娠維持。以往的文獻報道,外源性注射超生理劑量IFN-γ能造成小鼠流產(chǎn)和兔胚泡著床率降低;但低劑量IFN-γ對妊娠則有營養(yǎng)作用,不增加孕鼠流產(chǎn)率,并可增強免疫力;TNF-α作為一種致炎因子在腦組織中廣泛存在,與腦組織損傷及腦免疫功能存在著密切聯(lián)系,妊娠期異常分泌的大量TNF-α可能損害胎兒生長,引起流產(chǎn)和早產(chǎn);視上核(SON)、弓狀核(AN)和室旁核(PVN)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與生殖密切相關(guān)的核團。本研究用米非司酮(RU486)建立大鼠流產(chǎn)模型,通過外源注射不同劑量IFN-γ,檢測其對TNF-α表達以及妊娠結(jié)局的影響,以期為闡明IFN-γ通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用于妊娠的機理提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。材料和方法1.常用的妊娠合并pb模型雌性SD大鼠20只,體重220～250g。與雄鼠合籠,次日早晨做陰道涂片,發(fā)現(xiàn)大量精子者確定為妊娠第一天(1d)。孕鼠隨機分為四組,B組為模型組,孕10、11d灌服RU4863.75mg/kg建立流產(chǎn)模型;C、D組為IFN-γ處理組,同B組建立流產(chǎn)模型,同時孕9、10、11、12d分別腹腔注射IFN-γ1IU/g、10IU/g;A組為對照組,用生理鹽水處理,所有鼠于孕13d灌注取材,并觀察妊娠結(jié)局。取出腦塊,于含4%多聚甲醛的PB溶液中固定10h,然后移入含20%蔗糖的PB液中4℃過夜,待沉底后,在冰凍切片機上作連續(xù)冠狀切片,片厚35μm,隔2取1。切片收集在0.01mol/LPBS(pH7.4)中,分兩套,一套用于SP法免疫組織化學(xué)反應(yīng),一套用于陰性對照。2.小鼠血清中bap的檢測將切片經(jīng)0.01mol/LPBS漂洗2h后,依次按下列各步進行:(1)過氧化物酶阻斷溶液(試劑A),室溫下孵育1h;(2)非免疫性動物血清(試劑B),室溫下孵育1h;(3)兔抗TNF-α多克隆抗體(一抗1∶200,購于武漢博士德生物工程有限公司),室溫下孵育24h;(4)生物素標記的第二抗體(試劑C,福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供),室溫下孵育1.5h;(5)鏈親和素-過氧化物酶溶液(1∶200,試劑D),室溫下孵育60min。除第2步驟之后用0.01mol/LPBS(pH7.4)漂洗兩次,每次5min外,其它各步驟之間均漂洗3次,每次10min。其中一抗用含小牛血清白蛋白、0.03%疊氮鈉和0.2%TritonX-100的0.01mol/LPBS稀釋,第5步后漂洗3次,然后用DAB呈色15～20min。將呈色好的切片在0.01mol/LPBS中漂洗后,1%鉻礬明膠內(nèi)貼片,室溫下自然干燥,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡檢。陰性對照試驗用PBS代替一抗,其他步驟與上述一樣。3.陽性細胞的測量及統(tǒng)計分析將切片在Motic生物顯微鏡下拍照,用江蘇捷達801形態(tài)分析軟件對陽性細胞數(shù)及灰度值進行測量,并用SPSS11.5進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1.各組血清son、an和pvn表達情況B、C、D組三個核團內(nèi)TNF-α陽性產(chǎn)物的灰度值均較A組低(灰度值越低,著色越強),陽性細胞數(shù)均較A組高,差異顯著;C組SON和AN灰度值均高于B組,SON、AN和PVN陽性細胞數(shù)均低于B組(P<0.01,Fig.1A、C、E);D組灰度值均較C組低,陽性細胞數(shù)均較C組高(P<0.01,表1);與B組比較,D組PVN灰度值降低,AN、PVN陽性細胞數(shù)增高(P<0.01,Fig.1B、D、F表1)。2.各組患者妊娠和胚胎數(shù)比較A組胚胎粉紅,呈串珠狀,宮內(nèi)未見淤血,平均胚胎數(shù)為18.3±1.53;B、D兩組胚胎紫黑,較A組變小,或子宮呈竹節(jié)狀,胚胎消失,宮腔瘀血,陰道出血,平均胚胎數(shù)分別為2.8±2.83、2.2±1.92,與A組比較差異顯著(P<0.01),B、D組間無顯著差異;C組胚胎深紅,部分消失,陰道少量出血,平均胚胎數(shù)為13.5±2.07,與B、D組比較差異顯著(P<0.01)?？寡准八幬镒饔肨NF-α屬于Th1型細胞因子,高濃度TNF-α可通過多種途徑導(dǎo)致流產(chǎn):促進滋養(yǎng)細胞凋亡;提高前列腺素E2合成,興奮子宮平滑肌;激發(fā)Th1型免疫反應(yīng),排斥胚胎組織等。正常孕鼠SON、AN和PVN中有少量TNF-α表達,可能與促進垂體釋放催乳素(PRL)和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的釋放有關(guān),PRL促進卵巢黃體細胞發(fā)育,調(diào)節(jié)卵巢功能;而CRH則可刺激垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),ACTH又可通過增加糖皮質(zhì)激素(GC)的釋放,從而抑制炎性細胞因子表達,且不影響抗炎性細胞因子表達,從而有利于妊娠。RU486對孕酮受體(PR)有很強的親和力,PR存在于下丘腦、垂體、卵巢和子宮等處,RU486與之結(jié)合后,在受體水平特異性阻斷孕酮(P)的作用,引起蛻膜退變,對孕鼠有良好的抗生育效果。此外,RU486亦是GC受體拮抗劑,可阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)源性GC的作用,而生理劑量GC則可抑制腦中TNF-α的表達,若GC的作用被阻斷,可導(dǎo)致TNF-α表達增高。本研究通過給B、C、D組孕鼠灌服RU486,在每組SON、AN和PVN均出現(xiàn)TNF-α表達增強現(xiàn)象,增多的TNF-α一方面可能會影響這些核團中其它因子的分泌,另一方面可能通過與垂體間的聯(lián)系進入垂體,干擾垂體激素正常分泌,導(dǎo)致流產(chǎn)。IFN-γ也屬于Th1型細胞因子,高劑量IFN-γ能抑制P分泌,誘導(dǎo)胎盤細胞凋亡以及胎盤主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類抗原表達。而少量重組小鼠IFN-γ(rmu-IFN-γ)對妊娠具有營養(yǎng)作用:適量rmu-IFN-γ可促進孕鼠主動免疫,并且不提高流產(chǎn)率。姚文等報道:IFN-γ可能通過抑制PGF2α的合成來實現(xiàn)其促黃體作用。本實驗選用1IU/g、10U/g兩個劑量處理流產(chǎn)模型大鼠,發(fā)現(xiàn)1IU/gIFN-γ能明顯降低孕鼠流產(chǎn)率,并能減弱SON、AN和PVN中TNF-α表達;而10U/g劑量組流產(chǎn)率沒有降低,并且三個核團中TNF-α表達有增高趨