第1節(jié)基因工程的基本原理和技術(shù)課件

專題1 基因工程1DNA重組技術(shù)的基本工具

和基本操作程序復(fù)習(xí)2轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是我國(guó)目前最主要的轉(zhuǎn)基因作物，如何獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉呢？3基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因普通棉花(無(wú)抗蟲特性)棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)與載體DNA拼接，導(dǎo)入棉花植株(有抗蟲特性)表達(dá)4知識(shí)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建51.1基因工程的概念6結(jié)果原理一、基因工程的基本概念(原理)：“按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫DNA重組技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：定向改造生物的遺傳性狀以及克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙。別名 基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境

生物體外操作對(duì)象

基因操作水平

DNA分子水平獲得人類需要的基因產(chǎn)物或定向改造生物性狀基因重組(廣義)1抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)2抗蟲基因與載

體DNA連接3抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞分子手術(shù)刀——限制性內(nèi)切酶分子縫合針——DNA連接酶分子運(yùn)輸車——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體二、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉操作的基本工具

?72．基因工程的操作工具(1)基因的“分子手術(shù)刀”——

分布(來(lái)源)：限制性核酸內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶)8主要存在于原核生物中。

種類：約4000種。

作用特性：識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(切割具有專一性)

切割結(jié)果：產(chǎn)生兩個(gè)帶有黏性末端或

平末端的DNA片段切割磷酸二酯鍵9EcoRⅠ黏性末端黏性末端SmaⅠ平末端10平末端要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。11為什么原核生物的限制酶不能將自己的

DNA分子剪切掉？?DNA分子不具備該種限制酶的識(shí)別切割序列；②通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，限制酶不能識(shí)別。122．基因工程的操作工具(2)分子縫合針——

DNA連接酶13種類E·coli-DNA連接酶T4-DNA連接酶來(lái)源大腸桿菌T4噬菌體相同點(diǎn)都縫合磷酸二酯鍵DNA連接酶：把切下來(lái)的具有互補(bǔ)黏性末端或平末端的DNA分子拼接成新的DNA。(即將脫氧核糖與磷酸通過磷酸二酯鍵連接起來(lái))類型：E·coli

DNA連接酶或T4DNA連接酶14E·coli

DNA連接酶或T4DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)T4DNA連接酶(可用于連接平末端，但連接效率低)15限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別DNA連接酶與DNA聚合酶的區(qū)別限制酶DNA解旋酶DNA水解酶區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈切割磷酸二酯鍵將DNA水解為單個(gè)核苷酸易混辨析DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵區(qū)別2以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板相同點(diǎn)形成磷酸二酯鍵

16你能辨析限制酶與DNA連接酶、DNA聚合酶、DNA解旋酶作用不同點(diǎn)嗎？疑難解析例1如右圖為DNA，分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化圖中依次表示何種酶的作用？限制酶17DNA連接酶解旋酶DNA聚合酶2．基因工程的操作工具18(3)“分子運(yùn)輸車”——載體

條件：a能自我復(fù)制：具有復(fù)制原點(diǎn)，在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠保存和復(fù)制;b有一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)，能夠運(yùn)載多種目的基因

c有標(biāo)記的基因，如抗性基因、特殊生化表型基因d對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，不影響受體細(xì)胞正常的生命活動(dòng)

常用載體：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、某些動(dòng)植物病毒。常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有一個(gè)至多個(gè)酶切位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別19質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和酵母菌等生物體內(nèi)。質(zhì)粒是一種能自我復(fù)制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。二、培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉基因工程的基本操作程序

?211.2

基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、獲取目的基因2、構(gòu)建重組質(zhì)粒3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定22怎樣獲得蘇云金芽孢桿菌Bt毒蛋白基因？目的基因的獲取常有哪些方法？1、目的基因的獲取基因組文庫(kù)法cDNA文庫(kù)法PCR技術(shù)人工合成法23基因組DNA文庫(kù)24cDNA文庫(kù)（1）基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶脫落位點(diǎn)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容)非編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)

非編碼區(qū)編碼區(qū)下游內(nèi)含子外顯子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列

內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼區(qū)

：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄加工mRNA前體25成熟mRNA原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編碼區(qū) 編碼區(qū) 非編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游啟動(dòng)子 終止子非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)RNA聚合酶脫落位點(diǎn)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷(沒有內(nèi)含子)不編碼蛋白質(zhì)。調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子,下游有終止子原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

連續(xù)

的編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)

的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)

和具有調(diào)控作用的非編碼

區(qū)組成的2627（2）如果用PCR只擴(kuò)增所需目的基因的關(guān)鍵前提和條件是什么？過程如何？原理是什么？PCR技術(shù)前提：原理：過程:DNA復(fù)制高溫解鏈（變性）90-95℃\一段已知目的基因的核苷酸序列，合成引物低溫退火（復(fù)性）55-60 ℃

\子鏈延伸70-75

℃\

循環(huán)2829解鏈（變性）。雙鏈模板DNA解離為單鏈結(jié)構(gòu)。(90～95℃)退火（復(fù)性）。引物與模板互補(bǔ)成雙鏈。延伸。在Taq酶作用下，合成特異DNA序列。70～75℃每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。30（2）目的基因的獲取方法——

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因④

PCR反應(yīng)過程可分為三步：解鏈（變性）、退火(復(fù)性)、延伸易錯(cuò)辨析：PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較31PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理堿基互補(bǔ)配對(duì)原料四種脫氧核苷酸條件模板、能量、酶不同點(diǎn)解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化場(chǎng)所體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（taq酶）細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶1.已知DNA鏈的合成方向是5’→3’，若要擴(kuò)增出抗蟲基因并利于載體構(gòu)建，應(yīng)該選擇下圖所示的哪種引物？請(qǐng)說明理由。32抗蟲基因（3）目的基因的獲取方法——用DNA合成儀人工合成目的基因前提條件：基因比較小，核苷酸序列已知。 DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成設(shè)備：DNA合成儀3334如何構(gòu)建基因表達(dá)載體？基因表達(dá)載體包含哪些基本組成元件？通過cDNA文庫(kù)提取的目的基因需要加啟動(dòng)子和終止子嗎？2、構(gòu)建基因表達(dá)載體基因工程的基本操作程序2、表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心構(gòu)建目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以以傳給下一代?；虮磉_(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因啟動(dòng)子：位于目的基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出

mRNA，最終獲得所需蛋白質(zhì)。終止子：位于基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來(lái)。標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含目的基因，從而篩選出來(lái)。如：抗生素抗性基因復(fù)制原點(diǎn)：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以復(fù)制遺傳給下一代35易混辨析3637實(shí)際操作過程中，連接得到的DNA一定是重組DNA嗎？操作：目的基因自體環(huán)化你思考過實(shí)際操作過程中,如何防止酶切后的末端發(fā)生任意連接嗎？

基因表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)限制酶的選擇①根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶，但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)。②根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些

結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因。如果所選酶的切點(diǎn)不止一個(gè)，則切割重組后可能會(huì)丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后將不能自主復(fù)制。38基因工程的基本操作程序3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——轉(zhuǎn)化常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。方法導(dǎo)入方法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法39將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞——顯微注射法將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——感受態(tài)細(xì)胞原理：將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并將其插入到植物細(xì)胞染色體的DNA上。使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定的維持和表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用：此法比較經(jīng)濟(jì)和有效，約80%的轉(zhuǎn)基因植物都是通過這種方法獲得。農(nóng)桿菌特點(diǎn)：生活在土壤中，能夠在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，受植物體傷口處的細(xì)胞分泌的大量酚類化合物的吸引，農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞a.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(采用最多的方法)40b.基因槍法常用于單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化缺點(diǎn)：成本較高411)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞c.花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家周光宇獨(dú)創(chuàng)的一種方法實(shí)例：我國(guó)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：受自然花期限制，在自然田間進(jìn)行操作，受環(huán)境條件的影響很大?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ趾?jiǎn)便經(jīng)濟(jì)422)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最常用最有效的方法:顯微注射技術(shù)受體細(xì)胞：受精卵——原因是：受精卵全能性較高，可使外源基因在相應(yīng)的組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?；静僮鞒绦颍禾峒兓虮磉_(dá)載體體外顯微注射入受精卵經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后移植到雌性體內(nèi)受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物433)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞應(yīng)用最為廣泛的受體細(xì)胞是大腸桿菌方法：Ca2+處理法或者感受態(tài)細(xì)胞法第一步：用Ca2+處理細(xì)胞(以增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性)，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞；第二步：是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈,這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成.大腸桿菌是原核生物,不存在這兩種細(xì)胞器,因此在大腸桿菌生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的.4445如何檢測(cè)Bt毒蛋白基因是否成功導(dǎo)入棉花?最簡(jiǎn)單直觀的鑒定方法是?外源基因在受體細(xì)胞能夠表達(dá)的理論基礎(chǔ)？4、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序2).檢測(cè)4、目的基因的檢測(cè)與鑒定1).抗藥性篩選法——利用標(biāo)記基因?qū)霗z測(cè)

?

檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因–

方法——DNA分子雜交表達(dá)檢測(cè)方法——分子雜交翻譯檢測(cè)?

檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原抗體雜交核酸轉(zhuǎn)錄檢