珍珠對mc33-elisa細胞增殖分化間質(zhì)礦化及凋亡的影響

珍珠對mc33-elisa細胞增殖分化間質(zhì)礦化及凋亡的影響

骨質(zhì)疏松癥（op）是指骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)改變、骨脆弱增加、骨折風險增加的全身骨病。目前用于治療骨質(zhì)疏松的藥物主要分為兩大類:促骨形成藥物和抑制骨吸收藥物,兩者均能減少骨折發(fā)生率、增加骨礦密度,但是相關的不良反應和高昂的費用限制了它們的使用。珍珠作為一種名貴的中藥材,在我國的應用已有幾千年的歷史。珍珠粉有很高的藥用價值,主要成分為碳酸鈣、蛋白質(zhì)、水分及包括鐵、鋁、鎂、鋅、硒、銅、鉀、錳、鍶、鍺等多種微量元素及多種氨基酸。董娜等利用原子吸收光譜法測定珍珠粉中的微量元素發(fā)現(xiàn),其中的鈣含量最高(377.084mg/g),是主要成分,錳、鍶、鐵、鈉的含量也較為豐富,而鋅、錳、銅的含量較少。據(jù)資料報道,珍珠粉中富含的鈣元素和多種微量元素,對骨量減少和骨小梁變細、斷裂等病理改變有明顯改善作用。本文觀察了珍珠粉以及低鈣珍珠粉對MC3T3-E1細胞的增殖、分化、礦化和凋亡的作用,并對其作用機制進行初步探討。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和試劑珍珠粉(浙江長生鳥珍珠生物科技有限公司);MTT、TritonX-100(美國Amresco公司);β-甘油磷酸鈉、維生素C(美國Sigma公司);α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(美國Gibco公司);MC3T3-E1細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心);堿性磷酸酶(ALP)、考馬斯亮藍測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(美國BDPharmingen公司)。1.2藥物處理和組成1.2.1合成粉體中鈣離子取珍珠粉用1mol/LHCl溶解,模擬人體胃腸道消化過程,用PBS緩沖液稀釋到一定濃度,作為珍珠粉原液。另取定量珍珠粉原液,加入硫酸鈉溶液,完全沉淀鈣離子,作為低鈣珍珠粉溶液。采用原子吸收光譜法測定珍珠粉和低鈣珍珠粉中鈣離子濃度。結(jié)果顯示,50μg/mL珍珠粉和低鈣珍珠粉中鈣離子濃度分別為18.81μg/mL和1.89μg/mL,前者為后者的9.95倍。1.2.2不同鈣粉濃度對pbs-pcr菌毒的影響設正常對照組(Control),珍珠粉組(PearlPowder,PP)和低鈣珍珠粉組(LowCalciumPearlPowder,LCa-PP)。珍珠粉和低鈣珍珠粉分別用PBS緩沖液稀釋到一定濃度,0.45微孔濾膜過濾除菌,4℃保存。臨用前用細胞培養(yǎng)基配成所需濃度(5μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)。1.3方法1.3.1m培養(yǎng)基MC3T3-E1細胞用10%FBSα-MEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)基,待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶時,用0.25%胰酶消化,做傳代培養(yǎng)。1.3.2檢測方法及檢測指數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞按1×104個/mL密度接種于96孔板,每孔100μL,10%FBSα-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換以5%FBSα-MEM培養(yǎng)液,同時按照分組加入5%FBSα-MEM作為Control組,受試藥物PP(5μg/mL,50μg/mL,100μg/mL),LCa-PP(5μg/mL,50μg/mL,100μg/mL),每組6孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,每孔加入10μg/mL,5mg/mL的MTT,4h后小心吸棄培養(yǎng)液,再在每孔加入150μLDMSO(分析純),于酶聯(lián)免疫檢測儀上570nm波長處測各孔吸光度值,結(jié)果用OD570表示。實驗重復3次。1.3.3分組、給藥及測藥細胞按1×105個/mL密度接種于24孔板,每孔1mL,10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合80%后,換以成骨誘導培養(yǎng)基。成骨誘導培養(yǎng)基組成:5%FBSα-MEM培養(yǎng)液,50μg/mL維生素C,10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。同時按照分組加入5%FBSα-MEM作為Control組,受試藥物PP(50μg/mL),LCa-PP(50μg/mL),每組6孔,連續(xù)給藥14d。給藥結(jié)束后,吸棄培養(yǎng)液,加入1%TritonX-100溶液200μL,置4℃冰箱中放置1h以裂解細胞,然后按ALP檢測試劑盒及考馬斯亮藍蛋白定量法分別測定ALP值和蛋白含量,并計算出細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性。1.3.4礦化結(jié)節(jié)染色MC3T3-E1細胞以1×105/mL密度接種于24孔板,10%FBSα-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合80%后,換以5%FBSα-MEM培養(yǎng)液,同時加入50μg/mL維生素C及10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉,并按照實驗分組加入5%FBSα-MEM作為Control組,受試藥物PP(50μg/mL),LCa-PP(50μg/mL),每組6孔,2天換液1次。于第28天先用冰PBS洗細胞2遍,加入5%的AgNO3溶液,于紫外燈下照射1h。將AgNO3溶液吸出,細胞用蒸餾水洗3遍,加入5%的Na2S2O3溶液,5min后將細胞用蒸餾水洗2遍,1%的中性紅溶液染色5min,細胞用蒸餾水洗2遍以移除多余的染液,低倍光鏡下(200×)觀察礦化結(jié)節(jié)染色情況并拍照。實驗重復3次。1.3.5對血清饑餓誘導的細胞死亡的影響1.4統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(ue0af±SEM)表示,采用SPSS軟件統(tǒng)計單因素方差分析方法進行分析,組間比較采用Dunnett’stest檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1mc3t3-點細胞毒性檢測如Fig.1所示,與Control組相比,5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的PP和50μg/mL、100μg/mL的LCa-PP在24h作用范圍內(nèi)對MC3T3-E1細胞具有顯著性的促增殖作用(P<0.05,P<0.01)。2.2pp對alp活力的影響細胞在含有50μg/mL維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)液中連續(xù)誘導培養(yǎng)給藥14d后處理。Fig.2顯示,與Control組相比,PP組和LCaPP組ALP活力分別增加了92.77%(p<0.001)、34.63%(P<0.01)。提示對處于成熟期的成骨細胞,PP和LCa-PP均能顯著促進其分泌ALP,進而促進骨骼鈣化,然而,兩組之間存在顯著性差異(P<0.001),PP作用效果明顯強于LCa-PP。2.3礦化結(jié)節(jié)的測定MC3T3-E1細胞在含有50μg/mL維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)液中誘導培養(yǎng)給藥28d后進行VonKossa染色,可見礦化結(jié)節(jié)生成,VonKossa染色后呈現(xiàn)大小、形態(tài)不一的黑色陽性結(jié)節(jié)(Fig.3)。與Control組相比較,PP組和LCa-PP組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)均明顯增多,但是PP組明顯多于LCa-PP組。2.4骨細胞凋亡率由Fig.4可見,MC3T3-E1細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后細胞出現(xiàn)明顯的凋亡,而PP組、LCaPP組成骨細胞總凋亡率與Control組相比分別下降了43.53%、35.22%,具有極顯著差異(P<0.001)。2.5ranglmrna的表達量RT-PCR結(jié)果(Fig.5)顯示,各組受試藥處理成骨細胞21d后,與Control組相比,PP組和LCa-PP組的OPGmRNA表達量高達3.57倍和2.80倍,具有極顯著性差異(P<0.001),但是RANKLmRNA的表達量各組的增加幅度相對較小,PP組為1.36倍,LCa-PP組1.51倍。結(jié)果顯示,PP組和LCa-PP組對增加OPG的表達作用強于對RANKL的作用。然而與Control組相比,RANKL/OPG的比值(Fig.5C),PP組和LCa-PP組都顯著性降低(P<0.001),并且兩組間存在顯著性差異(P<0.01),PP組作用強于LCa-PP組。2.6mc3t3-e細胞早期分化和表達量檢測RT-PCR結(jié)果(Fig.5)顯示,各組受試藥處理細胞21天后,與Control組相比,在Runx2的mRNA表達量上,PP組和LCa-PP組明顯升高,差異具有顯著性(P<0.001,P<0.05),提示PP組和LCa-PP組均可以促進MC3T3-E1細胞的早期分化,且兩組存在顯著性差異(P<0.01),PP組作用強于LCa-PP組。同樣PP組和LCa-PP組均可顯著性升高OCmRNA的表達量(P<0.001,P<0.05)。提示兩組可以顯著促進成熟成骨細胞的分化與骨形成,其中PP組效果最明顯,LCa-PP組次之,兩組間存在顯著性差異(P<0.05)。3成骨細胞分化和骨髓結(jié)裂率的變化骨量的維持取決于骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡,該平衡失調(diào)將引發(fā)骨代謝性疾病。成骨細胞來源于間質(zhì)前體細胞,是骨發(fā)生和骨形成的物質(zhì)基礎,可合成和分泌20余種膠原與非膠原蛋白質(zhì)以及一些骨代謝的局部調(diào)節(jié)因子,在骨重建中生成類骨質(zhì)并促進類骨質(zhì)的礦化,形成的新骨質(zhì)修補破骨細胞骨吸收形成的陷窩,并且可以分泌細胞因子調(diào)節(jié)破骨細胞分化,因此在骨不斷的更新活動中是最重要的功能細胞之一。由于成骨細胞決定骨形成并維持成骨細胞和破骨細胞的平衡,成骨細胞成骨功能減退會導致新骨形成減少,對骨吸收陷窩的修補能力減弱,造成骨小梁變細、薄弱、穿孔,骨皮質(zhì)出現(xiàn)多孔性變化。因此研究藥物對成骨細胞增殖及分化作用的影響,對于觀察藥物的療效并探索其作用途徑和機制具有重要意義。本文通過檢測細胞增殖、ALP活性、礦化結(jié)節(jié)形成、無血清凋亡作用以及骨相關基因表達來考察珍珠粉對MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化的影響。結(jié)果顯示,珍珠粉及低鈣珍珠粉在對MC3T3-E1細胞分化成熟過程中有顯著性地促進作用,并且兩者存在顯著差異,前者作用效果顯著強于后者。ALP是成骨細胞分化成熟的早期標志,ALP通過分解基質(zhì)中的磷酸酯,使局部磷酸化,促進羥基磷灰石的形成,并在局部沉積,使基質(zhì)鈣化,同時水解焦磷酸,解除對骨形成的抑制。本實驗結(jié)果顯示PP和LCa-PP均可以于成骨細胞誘導培養(yǎng)14天后明顯的增強ALP的活性,且PP顯著強于LCa-PP(P<0.01),說明PP和LCa-PP可以刺激成骨細胞的早期分化進而影響成骨細胞的礦化,珍珠粉中鈣成分起主要促進作用。ALP活性的高表達是成骨細胞分化的早期標志,礦化則是細胞進一步分化成熟的功能表現(xiàn)。維生素C能促進成骨細胞合成Ⅰ型膠原,而處于成熟期的成骨細胞具有高活性的堿性磷酸酶,能將底物β-甘油磷酸鈉的磷酸鍵斷裂,從而提高培養(yǎng)基中無機磷濃度,促進鈣鹽沉積在膠原基質(zhì)中,因此成骨細胞在含有維生素C及β-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)基內(nèi)生長能產(chǎn)生獨特的礦化結(jié)節(jié),VonKossa染色法是用于檢測鈣沉積的傳統(tǒng)手段。本實驗中,PP和LCaPP均可以增加礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目和結(jié)節(jié)斑塊的大小,表明其促進了成骨細胞的分化成熟,含鈣成分的PP組效果強于去除鈣成分的LCa-PP組。成骨細胞凋亡與新骨基質(zhì)礦化有關,是骨代謝的一個重要過程,大約有70%,參與骨重建的成骨細胞都會凋亡。因此,絕經(jīng)后成骨細胞的異常凋亡也許會導致骨重建的不平衡,從而成為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要機制。本實驗證實PP和LCa-PP均可以抑制血清饑餓誘導的成骨細胞凋亡,表明兩者均具有抗成骨細胞凋亡的作用,兩組間不存在顯著性差異。Runx2屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族,是一種成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,能夠特異性的識別并結(jié)合許多靶基因啟動子上的PyGpyGGtPy序列,影響靶基因轉(zhuǎn)錄。Runx2主要在成骨細胞和肥大軟骨細胞中表達,是成骨細胞分化和功能的關鍵因子。Runx2可以誘導或促進骨基質(zhì)蛋白基因的表達,從而啟動未分化的間質(zhì)細胞或使已分化的其他類型的細胞向成骨細胞方向分化,是成骨細胞早期分化的標志性的基因。OC是由成骨細胞合成的一種非膠原蛋白,主要分布于細胞外基質(zhì),對骨基質(zhì)鈣化和礦化非常重要,是成骨細胞晚期分化的標志。RT-PCR實驗結(jié)果顯示PP和LCa-PP均可以上調(diào)Runx2和OC的基因表達,說明兩者既能夠增強成骨細胞的早期分化又能增強其晚期分化,PP組作用效果強于LCa-PP組(P<0.01,P<0.05)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),OPG和RANKL是調(diào)控破骨細胞激活分化的重要細胞因子,分別屬于腫瘤壞死因子受體和腫瘤壞死因子超家族成員。RANKL與破骨細胞或者其前體細胞表達的一類膜受體—RANK(receptoractivatorofNF-κB)受體特異性的結(jié)合,誘導前體細胞分化為活性破骨細胞,促進骨吸收。而OPG作為誘餌受體與RANKL結(jié)合,阻止其與RANK結(jié)合,從而抑制前體細胞激活為破骨細胞,抑制破骨細胞功能表達,從而拮抗破骨細胞的骨吸收作用,所以又被稱之為骨保護素。也就是說破骨細胞的激活和分化主要取決于RANKL和OPG相對含量的比值。本實驗中,PP和LCa-PP能顯著性增加OPG的基因表達(P<0.001),但是對RANKL的表達增加效果較弱(P<0.05,P<0.01)。OPG表達顯著增高而RANKL水平改變較小,結(jié)果就是導致了RANKL/OPG比率的明顯下降(P<0.001),從而說明兩者不但具有促骨形成作用,同時還可能抑制骨吸收,但兩組間存在顯著差異(P<0.01),PP組強于LCa-PP組。綜上所述,實驗結(jié)果顯示珍珠粉和低鈣珍珠粉均對體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞的分化成熟過程呈現(xiàn)直接促進作用,珍珠粉作用強于低鈣珍珠粉,兩組間存在顯著差異,說明珍珠粉中鈣成分對MC3T3-E1細胞分化成熟起到主要作用。然而,人體是一個復雜的環(huán)境,骨代謝受多種激素和因子的影響,藥物對骨形成的影響可能不僅僅通過其對成骨細胞的直接作用來實現(xiàn),還可通過對機體宏觀網(wǎng)絡的調(diào)控來完成,其作用途徑也有待進一步探討。取指數(shù)生長期MC3T3-E1細胞以1×105/mL密度接種于6孔板,10%FBSα-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用PBS液洗3次,再加無血清培養(yǎng)基并同時按照分組加入受試藥物PP(50μg/mL),LCa-PP(50μg/mL),以等量的1%FBSα-MEM培養(yǎng)液作為正常對照組