不同溶劑提取長(zhǎng)木蜂蜂糧粗提液的抑菌活性

不同溶劑提取長(zhǎng)木蜂蜂糧粗提液的抑菌活性

世界上大約有2萬(wàn)多只蜜蜂在參觀花卉，許多養(yǎng)蜂決定用蜜蜂營(yíng)養(yǎng)。蜂糧(Beebread)也稱蜂面包、蜂巢花粉,是采粉蜂將花粉團(tuán)卸落在巢房中,通過咬碎、吐蜜濕潤(rùn)等行為對(duì)花粉團(tuán)進(jìn)行初步加工,在微生物的作用下,封藏的花粉團(tuán)經(jīng)過一定時(shí)間的發(fā)酵所形成的蜂花粉釀制產(chǎn)物。蜂糧是幼蜂的食料,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。關(guān)于蜂糧的抗菌防腐活性也一直是人們長(zhǎng)期關(guān)注的問題[7,8,9,10,11,12,13,14],但有關(guān)蜂糧抗菌防腐的研究都以蜜蜂為對(duì)象,對(duì)其他花粉蜂的相關(guān)研究工作目前尚未見報(bào)道。長(zhǎng)木蜂(Xylocopatranquabarorum)屬于膜翅目蜜蜂科木蜂屬,在江蘇1年發(fā)生一代,是不貯蜜而專貯蜂糧的蜂類,營(yíng)獨(dú)棲性生活,主要于竹中筑巢,也有在蘆葦稈中筑巢;在1個(gè)巢孔內(nèi)建立多個(gè)獨(dú)立的巢室,每巢室做一塊蜂糧,在蜂糧上產(chǎn)卵后成蟲從巢室內(nèi)壁啃下碎屑,混合花粉和黏液將卵室膜狀封隔起來,向外再建卵室,并重新釀制蜂糧。每塊蜂糧約1.0cm×1.5cm,團(tuán)塊個(gè)體大,在巢中能較長(zhǎng)時(shí)期保持濕潤(rùn)狀態(tài)而不霉變。筆者以長(zhǎng)木蜂蜂糧為對(duì)象,通過不同的提取方法初步研究該蜂糧的抑菌活性,為進(jìn)一步探究長(zhǎng)木蜂蜂糧的防腐機(jī)理奠定基礎(chǔ),同時(shí),為開發(fā)新的天然防腐劑提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1微生物指標(biāo)測(cè)試2006年5月在南京林業(yè)大學(xué)北大山和南大山定點(diǎn)觀察長(zhǎng)木蜂的筑巢時(shí)期,在剛筑好的巢孔上方準(zhǔn)確標(biāo)記筑孔日期,根據(jù)長(zhǎng)木蜂的咬孔日期采集成熟程度一致的蜂糧。取標(biāo)記日齡的長(zhǎng)木蜂危害的枯竹,剖開后將長(zhǎng)木蜂放飛(長(zhǎng)木蜂可以繼續(xù)選巢釀貯蜂糧),已有蜂糧的枯竹帶回實(shí)驗(yàn)室,在無菌工作臺(tái)用消毒鑷子取出蜂糧后裝入5mL的滅菌指形管。每指形管裝入一塊蜂糧,貼上標(biāo)簽,放入4℃的冰箱中保存,備用。測(cè)試細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)和耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica);真菌為青霉菌(Penicilliumcitrinum)、黑曲霉菌(Apergillusoryzae)、根霉菌(Rhizopus)、毛霉菌(Mucor)、假絲酵母(Candidasp.)和啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae);除鰻弧菌和耶爾森菌由南京市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院贈(zèng)送外,其余均由南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院微生物教研室提供。細(xì)菌菌種在牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基37℃下培養(yǎng)24h,真菌菌種在PDA固體斜面培養(yǎng)基28℃下培養(yǎng)48h,4℃下保存?zhèn)溆谩?.2制備成浸液和液蜂糧沸水粗提液的制備:準(zhǔn)確稱取3份長(zhǎng)木蜂蜂糧5g,分別加入沸騰的無菌水45mL,沸水浴1h,在28℃、150r/min的搖床振蕩24h,然后用12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄沉淀取上清液,上述方法連續(xù)浸提3次,合并上清液。上清液在60℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)液濃縮,定容至30mL放入4℃冰箱中備用,雜質(zhì)放入60℃的烘箱中烘12h后稱重。蜂糧水粗提液制備:準(zhǔn)確稱取3份長(zhǎng)木蜂蜂糧5g,分別加入無菌水45mL,在28℃、150r/min的搖床振蕩24h,然后用12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄沉淀取上清液,上述方法連續(xù)浸提3次,合并上清液。上清液在60℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)液濃縮,定容到30mL放入4℃冰箱中備用,雜質(zhì)放入60℃的烘箱中烘12h后稱重。蜂糧乙醇粗提液制備:準(zhǔn)確稱取3份長(zhǎng)木蜂蜂糧5g,加入70%乙醇溶液45mL,在28℃、150r/min的搖床振蕩24h,然后用12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄沉淀取上清液,上述方法連續(xù)浸提3次,合并上清液。上清液在60℃的水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)液濃縮成浸膏,用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的乙醇溶解定容至30mL放入4℃冰箱中備用,雜質(zhì)放入60℃的烘箱中烘12h后稱重。蜂糧乙醚粗提液的制備:準(zhǔn)確稱取3份長(zhǎng)木蜂蜂糧5g,加入乙醇45mL,在28℃、150r/min的搖床振蕩24h,然后用12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄沉淀取上清液,上述方法連續(xù)浸提3次,合并上清液。上清液在60℃的水浴中揮去乙醚成浸膏備用,雜質(zhì)放入60℃的烘箱中烘12h后稱重。蜂糧二氯甲烷乙醇粗提液的制備:準(zhǔn)確稱取3份長(zhǎng)木蜂蜂糧5g,加入二氯甲烷45mL,在28℃、150r/min的搖床振蕩24h,在40~45℃的水浴4h,揮去二氯甲烷,用60%的乙醇溶解,12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄沉淀取上清液,上述方法連續(xù)浸提3次,合并上清液。上清液在60℃的水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏,雜質(zhì)放入60℃的烘箱中烘12h后稱重。蜂糧粗提液的溶解與稀釋:長(zhǎng)木蜂蜂糧沸水粗提液和水提液以冷藏定容30mL(0.5g/mL)為原液;70%的乙醇粗提液將濃縮的浸膏用5%的乙醇溶解定容至30mL為原液,0.22μm的細(xì)菌過濾器過濾后,采用倍比稀釋成3個(gè)質(zhì)量濃度梯度,即0.5、0.25和0.125g/mL,放入4℃冰箱中備用。1.3抑菌圈直徑測(cè)定細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)活化24h,真菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)活化48h后,以接種環(huán)取1環(huán)菌落,放入滅菌的無菌水中用微型旋渦混合儀振蕩10min,使微生物細(xì)胞分散,靜置20~30s,制成菌懸液,按照平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得含菌量為1×106cfu/mL。將上述培養(yǎng)16~18h的菌液,各涂布平皿0.1mL,置生化培養(yǎng)箱37℃恒溫烘干菌液,取出每塊平皿均勻放置3個(gè)(或5個(gè))牛津杯(每皿放置3個(gè)牛津杯的對(duì)照為3個(gè)重復(fù),對(duì)照和處理不在同一培養(yǎng)皿;每皿放置5個(gè)牛津杯的對(duì)照為6個(gè)重復(fù),每個(gè)處理組中設(shè)2個(gè)對(duì)照),在每個(gè)牛津杯中加入不同濃度長(zhǎng)木蜂蜂糧稀釋液各0.2mL,并相應(yīng)做好標(biāo)記。迅速小心移入生化培養(yǎng)箱37℃恒溫培養(yǎng)24~48h,每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù),及時(shí)觀察并記錄結(jié)果。沸水和水提液的對(duì)照組中加入無菌水0.2mL,70%的乙醇提取液的對(duì)照組中加入5%乙醇溶液0.2mL,培養(yǎng)條件相同。采用多功能型全自動(dòng)菌落/顯微圖像分析儀(杭州迅數(shù)科技有限公司生產(chǎn))進(jìn)行抑菌圈數(shù)據(jù)采集,抑菌圈直徑=處理直徑平均數(shù)-對(duì)照直徑的平均數(shù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。2結(jié)果與分析2.1蜂糧的抑菌活性測(cè)定長(zhǎng)木蜂蜂糧為凝膠塊狀物質(zhì),不同溶劑浸提其蜂糧的溶解性差別顯著:沸水提取的得率最高,為80.14%;水提取和70%乙醇提取得率差別不明顯,分別為78.71%和77.62%;乙醚提取得率最低,為22.96%。對(duì)提取率高的水溶劑和乙醇溶劑進(jìn)行抑菌活性的試驗(yàn)。不同溶劑的蜂糧粗提液原液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見圖1?？梢钥闯?長(zhǎng)木蜂蜂糧的水提液和乙醇提取液對(duì)兩種細(xì)菌均有很好的抑制作用,沸水粗提液的抑菌活性和70%乙醇粗提液的抑菌活性一致,都表現(xiàn)為對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于對(duì)大腸桿菌的抑菌效果,而水提液的抑菌效果表現(xiàn)為對(duì)大腸桿菌的抑菌效果略大于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果;70%乙醇提取液對(duì)兩種指示菌的抑菌活性最強(qiáng),抑菌圈直徑分別為(15.29±0.98)mm和(13.36±0.44)mm,沸水提取液和水提取液的抑菌效果無顯著差異(p>0.05)。沸水的提取得率較高,但抑菌活性沒有70%乙醇粗提液的抑菌活性強(qiáng),可能沸水煮沸過程中破壞了蜂糧的抑菌成分;金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌,通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)木蜂蜂糧對(duì)細(xì)菌的抑菌譜較寬,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用(圖2)。2.2蜂糧7%乙醇粗提液對(duì)3種外生菌的抑菌活性蜂糧70%乙醇粗提液對(duì)5種指示細(xì)菌均有不同程度抑菌活性(表1),抑菌活性從高到低依次為枯草桿菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、耶爾森菌。其中,對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性最強(qiáng),最大抑菌圈直徑為(23.61±0.89)mm,對(duì)鰻弧菌的抑菌活性次之,最大抑菌圈直徑(16.60±0.45)mm,對(duì)耶爾森菌的抑菌活性最弱。隨著提取液質(zhì)量濃度梯度增加其抑菌活性增強(qiáng),當(dāng)長(zhǎng)木蜂蜂糧粗提液質(zhì)量濃度為0.25g/mL以上,牛津杯附近有抑菌圈,抑菌圈中耶爾森菌的菌落數(shù)明顯少于抑菌圈外的菌落數(shù),而粗提液質(zhì)量濃度0.125g/mL時(shí)未表現(xiàn)出抑菌活性。蜂糧70%乙醇粗提液對(duì)6種指示真菌的抑菌活性較弱。在質(zhì)量濃度為0.5g/mL時(shí)對(duì)假絲酵母和啤酒酵母的抑菌圈直徑分別為(11.31±1.05)mm和(9.44±0.14)mm;質(zhì)量濃度低于0.25g/mL時(shí)沒有抑菌活性(圖3);蜂糧粗提液質(zhì)量濃度為0.5g/mL時(shí)表現(xiàn)出對(duì)青霉菌和曲霉菌的抑菌活性,在牛津杯周圍的菌絲明顯表現(xiàn)出異常變化,而對(duì)毛霉菌和根霉菌無抑菌活性。3長(zhǎng)木蜂糧的抑菌活性研究蜂糧是蜂采集的花粉混入顎腺分泌物,在有益微生物的作用下經(jīng)過復(fù)雜的生理生化過程發(fā)酵而成。蜜蜂蜂糧中含有肽和蛋白質(zhì)、黃酮類、活性多糖、多種維生素等活性成分,不同花粉源和不同蜂種蜂糧的成分組成可能不同。從長(zhǎng)木蜂蜂糧的溶解性看,其易溶于水、乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑,難溶于氯仿、乙醚、乙酸乙酯等溶劑,在自然放置過程中能長(zhǎng)期處于濕潤(rùn)狀態(tài)而不變質(zhì),初步推測(cè)長(zhǎng)木蜂蜂糧中的防腐物質(zhì)屬于易溶于水的極性物質(zhì)。該研究中長(zhǎng)木蜂蜂糧的抑菌活性與Nagai研究的蜜蜂蜂糧清除自由基能力的結(jié)果基本一致,說明長(zhǎng)木蜂蜂糧中也可能含有高的蛋白質(zhì)(或多肽)和酚類化合物等,這些物質(zhì)可能是其抑菌的活性物質(zhì)。長(zhǎng)木蜂蜂糧粗提液對(duì)細(xì)菌和真菌抑菌活性進(jìn)行的測(cè)定結(jié)果表明,長(zhǎng)木蜂蜂糧對(duì)細(xì)菌的抑菌活性明顯優(yōu)于對(duì)真菌的抑菌活性,對(duì)細(xì)菌的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰